TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法的建立及验证
时间：2023-06-26 09:15:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
毕华，卢宁，牛林茹，王玉哲，朱香，李文慧，杨凌，赵君，周勇，梁雅丽
1.中国食品药品检定研究院生检所重组药物室，北京 100050；
2.山西生物研究院有限公司，山西 太原 030000；
3.山西集创生物科技有限公司，山西 太原 030000；
4.君研生物科技（山西）有限公司，山西 太原 030000
胰蛋白酶Trypsin（Parenzyme）是一种从牛、羊、猪的胰脏提取的丝氨酸蛋白水解酶，为特异性最强的蛋白酶，主要应用于贴壁细胞培养时细胞的消化，可使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散［1-2］。
TrypLE 是一种通过生物工程制备的非动物源性胰蛋白酶类似物，目前主要应用于细胞培养中。其可替代传统的猪和牛的胰蛋白酶将细胞间蛋白质水解，从而使细胞离散或使贴壁细胞解离下来。Trypsin 作为通过动物体提取的酶类，存在批间差异大、纯度较低、有潜在动物源病毒感染等问题，且使用时必须添加特异性酶抑制剂才可中止消化［3］。而TrypLE 是利用基因工程技术制备的重组蛋白，纯度高，一致性好，特异性强，无动物源感染风险［4-5］。此外，TrypLE已被证明可解离无血清培养的细胞，作用细胞时更加温和，无需酶抑制剂，稀释即可终止反应，极大程度上减少了外来物质对细胞的干扰［6］。基于以上优点，TrypLE 已逐渐替代传统的胰蛋白酶在细胞培养中发挥作用，并广泛应用于国内外的生物技术药物生产工艺中。
胰蛋白酶现行标准收载于《中国药典》二部（2020版），收录的检测项目未包含残留量检测，滞后于目前药品生产与质量控制中的要求［7］。这不仅在细胞培养过程中会带来潜在的风险，给相关生物制品的临床使用造成安全隐患，也是生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制中仍需完善的一环。TrypLE作为广泛应用于制药工艺的胰蛋白酶类似物，其残留检测的重要性也愈发显著。本研究旨在建立一种双抗体夹心ELISA 定量检测方法，并进行验证及初步应用，以期可有效、快速、便捷地检测样品中TrypLE的含量。
1.1 生物制品类样品 痘苗病毒（1、2）、慢病毒、单纯疱疹病毒和干细胞治疗药物均由山西医科大学第一附属医院惠赠。
1.2 主要试剂及仪器 TrypLE标准品（批号：2215065）购自美国GIBCO公司；
胰蛋白酶（批号：20210318）购自北京索莱宝科技有限公司；
重组胰蛋白酶（批号：20210221）购自上海雅心生物技术有限公司；
牛血清白蛋白（批号：7151）购自美国MP Biomedical 公司；
核酸酶（批号：B7919790）购自上海翊圣生物科技有限公司；
BCA 法微量蛋白质浓度测定试剂盒（批号：G914DA0005）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
兔抗TrypLE 多克隆抗体委托金斯瑞生物科技有限公司制备；
HRP 标记的TrypLE 兔多克隆抗体为中国食品药品检定研究院生检所重组药物室制备；
酶标仪（M190）购自美国MD公司。
1.3 标准品浓度标定 使用BCA 蛋白质浓度检测试剂盒对TrypLE 原液进行蛋白质定量检测，由3 名实验员在1 个月内分别重复检测30 次，计算结果的均值。具体步骤按照试剂盒说明书进行。
1.4 双抗体夹心ELISA方法的建立 将兔抗TrypLE多克隆抗体作为捕获抗体，用包被缓冲液（0.05 mol／L碳酸盐溶液，pH 9.6）稀释成1、2、3、4 μg／mL 后，加入酶标板，100 μL／孔，4 ℃包被过夜；
PBST 洗涤，加入封闭液（含3%BSA的PBST溶液），200 μL／孔，37 ℃封闭 2 h；
PBST 洗涤，加入稀释至 40 ng／mL 的TrypLE标准品和阴性对照（PBST溶液），100 μL／孔，37 ℃温育2 h；
PBST 洗涤，加入HRP标记的兔多克隆抗体作为检测抗体（1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000稀释），100 μL／孔，37 ℃温育1.5 h；
加入TMB显色液，37 ℃避光温育15 min；
加入终止液（2 mol／L浓H2SO4），使用酶标仪检测波长450 nm 处的吸光度值。以P／N ≥ 2.1为阳性，P／N ＜ 2.1为阴性［8-9］。
1.5 方法的验证
1.5.1 线性范围 将TrypLE 抗原标准品系列稀释至0.41 ～40.00 ng／mL，用建立的双抗体夹心ELISA方法重复检测3次，以抗原浓度为横坐标，A450值为纵坐标，使用四参数拟合绘制标准曲线。
1.5.2 特异性 使用建立的方法检测梯度稀释的TrypLE、胰蛋白酶、重组胰蛋白酶［10］、牛血清白蛋白以及核酸酶浓度，验证方法的特异性。
1.5.3 检测限 用样本稀释液（PBST溶液）作为样本重复测定20次，得出20次测定结果的A450值，计算平均值（M）和标准差（SD），得出M+ 2SD对应的A450值，带入标准品的标准曲线方程，求出对应的浓度值，即为检测限。
1.5.4 定量限 将标准品分别稀释至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ng／mL 后，重复测定各 10 次，结果的平均值记为M1 ～M10。根据公式：测量偏差=（M-理论值）／理论值×100%，计算10 次测定结果的M和SD，得出变异系数（CV=SD／M× 100%）。选取CV≤15%的最低浓度作为定量限。
1.5.5 准确性
1.5.5.1 测量偏差 将标准品稀释至高（32 ng／mL）、中（20 ng／mL）、低（2 ng／mL）3个浓度后，分别测定3次，计算M值及测量偏差。
1.5.5.2 加标回收率 将待测样品分为等体积4份。其中 3 份中加入等体积浓度为 40、16、6.4 ng／mL 的标准品，加入体积小于原体积的10%，计算加入的待测物浓度；
在另一份样品中加入等体积的PBST 溶液，制成基础样本。对样本进行3 次重复测定，计算均值，并按下式计算加入浓度和回收率。
加入浓度= 标准液浓度× 标准液体积／（样本体积+标准液体积）；
回收率（%）=（待回收样本浓度均值- 基础样本浓度均值）／加入浓度×100%；
平均回收率（%）=（回收率1 + 回收率2 +…+ 回收率n）／n×100%
1.5.6 重复性 分别将不同浓度的标准品A（40 ng／mL）和 B（16 ng／mL）、C（6.40 ng／mL）和D（2.56 ng／mL）等体积混匀制成不同浓度的检测样本，其中A+B理论浓度为28 ng／mL，C+D理论浓度为4.48 ng／mL，各重复检测10次，计算M、SD和CV。
1.6 样品检测 用建立的方法检测痘苗病毒（1、2）、慢病毒、单纯疱疹病毒、干细胞治疗药物样品。将不同样品进行初步检测，并按照加标回收率检测方法，加入不同浓度的标准物质，计算回收率，以验证检测系统对不同种类样品的适用性。
2.1 标准品浓度标定 3名实验员采用BCA法在1个月内分别重复检测30 次TrypLE 原液的均值分别为20.11、20.17、20.09 μg／mL，总均值为20.12 μg／mL，最终确定标准品原液的浓度为20.12 μg／mL。
2.2 双抗体夹心ELISA方法的建立 不同浓度检测抗体和捕获抗体A450值见表1。综合考虑强抗原的A450值在2.0左右、空白值较低、P／N值为阳性且数值最大的组合，最终选定捕获抗体用3 μg／mL浓度包板，酶标检测抗体稀释15 000倍的组合建立检测方法。
表1 不同工作浓度的两种抗体组合的A450值Tab.1 A450 values of combinations of two antibodies at various working concentrations
2.3 方法的验证
2.3.1 线性范围 标准曲线见图1。曲线拟合方程为：y=（5.66-0.042）／［1+（x／57.88）-1.20］+0.042，r2=1.000，表明在0.41 ～40.00 ng／mL范围内线性较好。
图1 标准曲线Fig.1 Standard curve
2.3.2 特异性 使用建立的方法检测多种酶和蛋白质，除TrypLE 外，不同浓度的胰蛋白酶、重组胰蛋白酶、牛血清白蛋白和核酸酶的A450值均小于0.1，见图2。表明与浓度无相关性，该方法具有较好的特异性。
图2 建立的ELISA法检测不同样品的结果Fig.2 Results of various samples detected by the developed ELISA
2.3.3 检测限 用建立的方法检测20次样本稀释液的平均A450值为0.046，SD为0.001 6，根据公式A450=M+2SD，得到A450=0.050，带回原标准曲线，求得检测限为0.258 ng／mL。
2.3.4 定量限 低浓度标准品重复测定10 次，CV≤15%的最低浓度为0.5 ng／mL，见表2，因此选择此浓度作为定量限。
表2 低浓度定量限检测结果Tab.2 Detection results of low concentration LOQ
2.3.5 准确性
2.3.5.1 测量偏差 高、中、低浓度标准品检测结果的测量偏差均小于5%，见表3。表明建立的方法准确性较好。
表3 高、中、低浓度标准品的测量偏差Tab.3 Measurement deviation of standards at high，medium and low concentrations
2.3.5.2 加标回收率 不同加标浓度样品的回收率均在80% ～120%以内，见表4。表明其他干扰物质对本方法准确性影响较小。
表4 加标回收率检测结果Tab.4 Detection result of spike recovery
2.3.6 重复性 样品A+B 的M和SD分别为25.904和 0.463 ng／mL，C + D 的M和SD分别为 4.212 和0.165 ng／mL；
A+B 和 C+D 的CV分别为 1.79% 和3.91%，均＜5%。表明该方法重复性好，结果稳定，对外界干扰因素的抵抗能力强。
2.4 样品检测 所有样品的加标回收率均在80% ～120%之间，见表5，表明检测结果准确可信。其中痘苗病毒样品1 和慢病毒样品的回算浓度低于检测限，痘苗病毒样品2、单纯疱疹病毒样品和干细胞治疗药物样品的回算浓度较大，表明此3 种样品中有明显的TrypLE残留。
表5 不同类型生物制品样品检测结果Tab.5 Detection results of various types of biological products
目前，生物制品得到越来越广泛的使用，其质量控制的要求也愈加严格，如生物技术药物中的重组单抗类制品、疫苗类制品、基因治疗制品与治疗性重组蛋白等［11］。在《中国药典》二部（2020版）中均有明确的质量控制检测项目，包括鉴别试验、理化测定、分子大小、结构特征、异常毒性检查、无菌检查、细菌内毒素检查、佐剂、抑菌剂及工艺杂质残留量检测等，其中工艺杂质残留检测是多种类别生物制品的共同检测项目，其中包括对于细胞培养残留物、生物原材料残留物等的检测。
一项研究将人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）用TrypLE 和胰蛋白酶（酶促组）和乙二胺四乙-EDTA（非酶促组）处理后进行转染，发现酶促组转染后无法稳定细胞活力和hESCs 的回收率，也无法保持与正常组相似的细胞功能水平［12］。另一项研究采用酶促法（TrypLE）与非酶促法（乙二胺四乙酸和刮擦法）分离人类骨髓间充质基质细胞（mesenchymal stem cell，MSC），并对MSC 活力、趋化因子受体表达、多潜能、免疫调节和趋化因子依赖性迁移进行检测，结果表明，TrypLE导致了细胞表面趋化因子受体表达的丧失，细胞活力降低，多能性和免疫调节受到影响［13-14］。此外，长期以来，暴露于酶粉尘已引起呼吸道职业性超敏反应，一些研究已报道了由含胰蛋白酶产品引起的特定气道致敏的明确病例［15］，而 TrypLE 作为胰蛋白酶类似物，也极有可能存在一定的致敏性。
本研究建立了针对胰蛋白酶类似物TrypLE 的检测方法，并进行了全性能验证。该方法在0.41 ～40 ng／mL范围内的R2＞0.99，呈良好的线性；
方法的灵敏度可达0.258 ng／mL，定量下限设在0.41 ng／mL，表明灵敏度较高，检测范围较广。用该方法检测了胰蛋白酶、重组胰蛋白酶等，发现无交叉反应，表明该方法特异性好。通过重复测定不同浓度的样本，表明该方法标准偏差较低、加标回收率稳定在80% ～120%，符合相关行业标准的性能指标，表明整个检测系统准确稳定，抗外界物质干扰能力较强。
此外，采用建立的方法检测了不同类型的生物药物，如基因治疗类药物、细胞治疗类药物等，结果表明，不同样品的加标回收率均达到较好的范围，表明该方法对不同类型样品均具有良好的适用性。
综上所述，本研究建立的方法可稳定、有效、快捷地检测样品中TrypLE 的含量，可用于细胞培养或生物医药生产中TrypLE 的定量检测，帮助企业更好地进行产品的质量控制。生物技术药物的快速发展对于质控检测产品提出更高的要求，本研究将在后续进一步开展本方法对于更多种类药物，如抗体、疫苗等的适用性评估［16］，并继续优化方法的性能。
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