一株富含多不饱和脂肪酸杜氏藻的鉴定和优化培养研究❋

陈仁霞，朱葆华，曹子豪，李 赟，靳桂勇，潘克厚,2❋❋

(1.海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 266003; 2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237)

微藻作为水体环境中的初级生产者，可高效利用太阳能将CO2和H2O转化为淀粉、油脂和多糖等有机物，目前已被广泛开发应用于生物柴油和生物饵料领域[1]。然而，微藻在生产过程中存在生物量低和生产成本高的问题，且在不同环境条件下微藻的蛋白质、类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸等活性物质的含量不同，这些问题阻碍了微藻的规模化生产。当前，主要的解决途径是筛选活性物质含量高的藻种并通过优化其培养条件获得较大的生物量[2-3]。

多不饱和脂肪酸对机体有非常重要的生理调节功能[4]。例如二十碳五烯酸(EPA)能降低血液中甘油三酯和胆固醇的含量，从而加快体内饱和脂肪酸的代谢速率[5]；
二十二碳六烯酸(DHA)是促进大脑发育的重要物质，被认为具有诱导神经再生的功能[6]；
EPA与DHA是神经细胞膜的重要组成成分，主要从深海冷水鱼鱼油中获取，资源稀缺。有研究表明α-亚麻酸可以在人体内通过去饱和酶和延伸酶的催化，转化为EPA和DHA[7]。此外，α-亚麻酸还有增长智力、保护视力和延缓衰老等功效，具有重要的药用及经济价值；
多不饱和脂肪酸中的亚油酸有降低血液胆固醇、降血压和防治动脉粥样硬化等功效，被称为“血管清道夫”[8]。亚麻酸和亚油酸都是人体必需的脂肪酸，需从外界获取，因此亟需寻找富含亚麻酸及亚油酸的原料。微藻具有富含多不饱和脂肪酸、生长快和可直接食用等优点，成为生产亚麻酸、亚油酸和EPA等多不饱和脂肪酸的重要原料。

杜氏藻(Dunaliella)属于绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)团藻目(Volvocales)杜氏藻科(Dunaliellaceae)。杜氏藻对盐度有广泛的适应性，在盐度2～350的水域均能存活[9]。另外杜氏藻富含多糖、类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸等活性物质，具有无细胞壁、生长速度相对较快和抗逆性强等优势被广泛应用于规模化生产。因为杜氏藻的生物量易受温度、盐度和光照等培养条件的影响[10-12]，所以可以通过优化培养条件获得更高的生物量和更丰富的活性物质[13]。

本研究对一株分离自内蒙古哈马太湖的藻株进行了形态学和分子生物学鉴定，确定该藻株为Dunaliellasp.，将其命名为HK128。并在此基础上探讨不同培养条件对HK128生长的影响，初步评估HK128生产多不饱和脂肪酸的潜力，进而为其开发利用提供理论依据。

1.1 藻种、培养条件及培养基

HK128是从内蒙古哈马太湖(39°06′N，108°02′E)中分离的一株绿藻。哈马太湖常年平均水深1.5 m，四季温度12.5～26.0 ℃，pH在8.5以上。基于哈马太湖水域微碱的特点，将分离的HK128接入Zarrouk培养基中进行为期7 d的预培养，而后收获、转接，进入正式培养。预培养在光暗比12 h∶12 h，温度25 ℃，光照强度75 μmol/(m2·s)和转速160 r/min的光照震荡培养箱中进行。

1.2 HK128的鉴定

本实验在Zeiss imager Z2微分干涉显微镜下对HK128进行形态学观测，包括藻细胞形态和大小。随后取指数生长期的藻液，用HP Plant DNA Kit(50)试剂盒法(OMEGA)提取HK128微藻基因组DNA，并设计2对引物18SF: 5’GCTGAAACTTAAAGGAATTGACGG3’, 18SR: 5’GAGAGCCAAGATATCCGTTGTTG3’；
5.8SF: 5’TGCTGAAACTTAAAGGAATTGACG3’，5.8SR: 5’ GAGAGCCAAGATATCCGTTGTTG3’分别扩增18S rDNA和5.8S rDNA部分序列[14]。PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。获得的扩增序列经与GenBank中相关序列信息进行BLAST相似性检索，选取相似性大于97%的序列，以光滑念珠菌(Candidaglabrata)、衣藻(Chlamydomonas)和小球藻(Chlorella)等作外类群，用Mega5.1邻接法(Neighbor-joining)建立系统进化树，重复1 000次计算bootstrap值，用于分离藻株的分子鉴定。

1.3 HK128培养条件优化

为优化HK128的培养条件，本研究分别比较了在不同的培养基、初始pH和盐度等条件下(见表1)藻株HK128的生长情况。实验流程为:先筛选出适宜HK128生长的培养基，然后进行温度、初始pH、盐度和光强的优化。

表1 实验变量及变化范围

1.4 分析方法

1.4.1 藻细胞密度及生物量测定 利用藻细胞的光密度(OD)和单位体积藻液中的藻细胞干质量(DCW)表征藻细胞的生长情况。藻细胞光密度(OD)采用分光光度计测定750 nm波长下的吸光值。用血球计数板法统计细胞密度，建立细胞密度与吸光度之间的标准曲线：

Y=1374.5X-159.76,R2=0.99。

藻细胞光密度OD750与细胞密度的相关性系数为0.99，显示OD750与细胞数之间具有较好的相关性。

藻细胞干质量的测定方法如Lamers等[15]所述。将GF/C玻璃纤维素膜(直径47 mm，孔径0.45 μm)烘至恒重m0。取5 mL藻液，抽滤藻液至生物膜上，将生物膜放入65 ℃的烘箱，烘干至恒重m1。利用公式：藻细胞干质量(g/L)=(m1-m0)×200得出微藻的生物量。

1.4.2 藻细胞的叶绿素a、b及总类胡萝卜素含量的测定 取第7天指数生长期的藻液5 mL测定叶绿素a、b以及总类胡萝卜素，测定方法采用95%乙醇提取法[16]。按以下公式计算藻细胞的叶绿素含量：

CChlorophyll a(mg/L)=13.95×OD665-6.88×OD649；

CChlorophyll b(mg/L)=24.96×OD649-7.32×OD665；

2.05×Chlorophylla-114.8×Chlorophyllb)。

式中：C表示叶绿素含量；
T表示总类胡萝卜素含量；
OD665、OD649和OD470分别表示藻液在665、649和470 nm下的光密度值。Chlorophylla表示叶绿素a，Chlorophyllb表示叶绿素b, Total carotenoids表示总类胡萝卜素。

1.4.3 藻粉主要生化成分的测定 初始接种的OD750为0.2左右，收集第7天的藻液，离心(4 500 r/min，4 ℃，10 min)，蒸馏水洗涤2次，再次离心后倒掉上清，收集藻泥并于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，冷冻干燥的藻粉放置于玻璃干燥皿中避光暂存。

1.4.3.1 可溶性总蛋白含量测定 采用BCA蛋白测定试剂盒法测定可溶性总蛋白[17]。称取0.03 g冷冻干燥的藻粉，加入3 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH=7.4)于10 mL离心管中，冰浴条件下进行超声细胞破碎。取离心后上清20和200 μL试剂混合(1 mL Cu试剂和50 mL BCA试剂混合)，加入酶标板中，放恒温培养箱于37 ℃孵育25 min。最后，用酶标仪562 nm波长测吸光值，通过牛血清蛋白标准曲线Y=0.847 7X+0.080 9,R2=0.99换算得到藻粉中可溶性蛋白的含量。

1.4.3.2 多糖含量测定 采用硫酸蒽酮法测定微藻中多糖含量[18]。称取0.01 g冷冻干燥后的藻粉，加入6 mL磷酸缓冲溶液于10 mL离心管中，振荡混匀。超声破碎20 min，沸水浴30 min。取4 mL溶液，加0.2 mL硫酸锌，沸水浴5 min；
加0.4 mL亚铁氰化钾，振荡混匀后离心。取1 mL上清于玻璃管中，加入硫酸蒽酮溶液4 mL，沸水浴10 min，冷水迅速冷却至室温15 min。测量620 nm处的吸光值，并通过制作的葡萄糖标准曲线Y=0.006 3X+0.030 1,R2=0.99，换算得到藻粉中多糖的含量。

1.4.3.3 总脂含量测定 采用质量量法[19]，称取0.04 g(m0)冷冻干燥的藻粉，加2 mL氯仿和1 mL甲醇于10 mL离心管中，涡旋振荡混匀12 h。将离心管放置于有冰水混合物的玻璃烧杯中，超声破碎20 min。离心(4 500 r/min)10 min，将上清液移至新的离心管中。重复3次上述过程，该过程合并所有上清至新的离心管中。上清液中加入1.2 mL 0.9%NaCl，涡旋震荡后，静置分层。吸取下层液体，转移至恒重的玻璃管中(m1)用水浴将液体完全挥发，放置于65 ℃烘箱中烘干，冷却至恒重称重m2。总脂含量：

TTotallipidcontent=((m2-m1)/m0)×100%。

1.4.3.4 藻粉脂肪酸组成分析 采用Lamers等[15]气相色谱分析方法，称取0.01 g藻粉,加入1 mL(2 mol/L)KOH-CH3OH溶液，混匀，将玻璃管放入75 ℃水浴锅中皂化，甲酯化30 min，冷却至室温。加入1.5 mL HCl-CH3OH(3 mol/L)溶液，混匀。75 ℃水浴锅中酸化30 min，冷却至室温。加入2 mL蒸馏水，0.5 mL正己烷，混合均匀。3 500g离心10 min。吸取上层正己烷注入棕色进样瓶中，冷冻避光保存，供色谱分析。将气相色谱仪的条件设置如下：进样口温度250 ℃；
内部程序升温至150 ℃维持1 min，再以15 ℃/min升高到250 ℃保留10 min；
载气为N2和H2，流速分别为40和25 mL/min。采用面积归一法，将样品所有组分都显示出峰值，实验结果用被测组分的面积占总面积的百分比表示。

1.5 数据分析

计算3个重复实验的平均值及标准差(n=3)，进行统计分析。采用SPSS分析软件进行单因素方差分析，p<0.01表示差异极显著，p<0.05表示差异显著，用Origin Pro 9.1进行作图分析。

2.1 HK128的形态学观察及分子生物学鉴定

用玻璃微吸管法将分离的藻株在Zarrouk培养基中培养，培养7 d后镜检。在48孔板中将目标藻株进行多次稀释，并在固体Zarrouk培养基中涂布获得单藻落。挑取单藻落转入液体培养基，在光暗比12 h∶12 h、温度25 ℃、光照强度75 μmol/(m2·s)条件下培养。在液体培养基中HK128藻细胞呈绿色的纺锤形(见图1)，长8～10 μm。有2条等长的顶生鞭毛，游动迅速。细胞侧缘有一个红色的眼点，中部有一个杯状色素体。藻细胞没有坚硬的细胞壁，周边只有一层薄薄的生物膜包裹。根据藻细胞形态初步确定HK128为一株杜氏藻。

图1 HK128藻细胞形态

本研究扩增得到的HK128 18S rDNA和5.8S rDNA序列长度分别为865和915 bp。结果显示，获得的与HK128序列相似性大于97%的序列共12条，均为杜氏藻属的微藻。使用Mega5.1的邻接法(Neighbor-joining)，利用扩增序列及相似性较高的序列构建18S rDNA和5.8S rDNA序列系统进化树(见图2)。结果显示，HK128的18S rDNA与杜氏藻属中Dunaliellasalinastrain(KMMCC1064)在NJ树上聚为一支，相似距离为95%。HK128的5.8S rDNA与杜氏藻属中特氏杜氏藻Dunaliellatertiolectastrain(CCAP19/23)在NJ树上聚为一支，相似距离达100%。核糖体5.8S rDNA具有很低的遗传保守性，是进行生物种内及种间的理想分子标记[20]。但由于杜氏藻属微藻在分类鉴定中仍存在着许多争议，且分类体系尚未完全确立，所以本研究结果只能表明HK128藻株是Dunaliellasp.。

图2 基于18S rDNA和5.8S rDNA序列信息构建的系统进化树(Neighbor-joining法)

2.2 HK128的适宜培养基

HK128在3种培养基中培养7 d，结果显示(见图3)，HK128在Zarrouk培养基(盐度20，pH 9.5)中生长最优。在0～7 d保持持续增长的趋势，培养基颜色逐渐加深至墨绿色。培养至第7天，HK128在Zarrouk培养基中的OD750是在f/2培养基(盐度30，pH 8.11)中OD750的2.02倍，是在BG11培养基(盐度5，pH 7.23)中OD750的5.43倍。说明HK128藻株更适合在Zarrouk培养基中进行培养。

((a)HK128在三种培养基中OD750的变化;(b)第7天HK128藻液颜色。(a)Changes of OD750 of HK128 in three media;(b)Day 7 HK128 algal liquid color.)

2.3 HK128培养条件优化

Santhanam等[21]和Dinesh Kumar等[22]的研究结果表明温度、盐度和光强等培养条件对微藻细胞的生长有显著影响。有报道表明D.salina在30 ℃、D.viridis在37 ℃、D.tertiolecta在26 ℃生长最佳[23]。本研究中，HK128在20、25和30 ℃具有相同的生长趋势(见图4(a))，在第7天25 ℃时HK128藻细胞的OD750(1.5)显著高于20 ℃(1.4)和30 ℃(1.1)时的OD750(p<0.01)，说明HK128合适的培养温度为25 ℃，与已报道的研究结果基本一致[22]。在户外实际生产过程中，温度波动大，HK128藻株有较宽的温度适应范围，这对于实际生产有重要意义。

pH从改变环境酸碱度和碳酸盐平衡系统(CO2+H2OH2CO3H++HCO3-2H++CO32-)两方面对微藻的生长产生影响[24-25]。本实验利用NaHCO3和Na2CO3不同的添加比例来调节Zarrouk培养基的初始pH(9.3～11.5)。如图4(b)所示，随着培养液初始pH增大，藻细胞生长速度逐渐降低。在第7天,高pH组(pH=11.0和pH=11.5)的细胞密度显著低于低pH组(pH=9.3和pH=9.5)的细胞密度(p<0.05)，这表明HK128藻株适宜初始pH为9.3～9.5。Mclachlan等[26]发现杜氏藻能在pH为6.0～10.5的环境中正常生长，最适值为8.0～9.0，这与本研究的结果基本一致，说明HK128藻株对碱性环境具有较强的耐受性。

在温度25 ℃、光暗比12 h∶12 h、初始pH=9.3，光强75 μmol/(m2·s)培养条件下，通过向Zarrouk培养基添加0～1.0 mol/L NaCl将培养液盐度调至20～55，比较HK128的生长情况。结果显示(见图4(c))，HK128藻株在盐度20～41的培养基中1～7 d持续增长，较低盐度组(20和27)的细胞密度显著高于较高盐度组的细胞密度(34和41)，而在高盐度组(48和55)HK128藻细胞不能正常生长，可见HK128是一株适宜低盐度培养的杜氏藻，与Cifuentes等[27]发现D.tertiolecta适宜在低盐度生长的结果一致。HK128藻株适应低盐度的原因可能是长期培养于低盐度的培养基中。

光强对HK128生长的影响如图4(d)所示，在光强为75～200 μmol/(m2·s)范围内，HK128藻株的OD750随着光照强度的增加相应提高，但当光强超过200 μmol/(m2·s)，再提高光强并未明显促进藻细胞的生长，但也未出现明显的光抑制现象，说明HK128对高光强具有很强的适应性。

图4 HK128的OD750在不同温度(a)、初始pH(b)、盐度(c)和光强(d)下的变化

在上述获得的优化条件下，即温度25 ℃，初始pH=9.3，盐度20，光强200 μmol/(m2·s)，在第7天HK128的生物量可达3.6 g/L，是Morowvat等[28]优化的D.salina生物量(1.015 g/L)的3.54倍。此外，随着培养时间的延长，培养基的pH从初始的9.3增至第7天的10.23(见图5)，说明HK128具有较强的pH耐受特性。

图5 在优化条件下HK128生物量(a)及pH(b)的变化

收集培养至第7天的藻粉，分析HK128的主要生化成分，结果如表2所示。其总脂含量为细胞干质量的24.83%、可溶性蛋白为细胞干质量的17.70%、多糖为细胞干质量的11.99%、叶绿素含量为26.00 mg/L、类胡萝卜素含量为5.74 mg/L。Fazeli等[29]研究结果表明，D.tertiolectaDCCBC26在含有0.3 mol/L NaCl的培养基中叶绿素a含量为9.84 mg/L、类胡萝卜素含量为3.75 mg/L。姜建国等[30]分析了5种杜氏藻的生化组成发现Dunaliellabardawil847、Dunaliellabioculata199、Dunaliellaprimolecta818、Dunaliellasalina435和Dunaliella558的总脂含量在11.7%～20.8%，相比上述已报道的杜氏藻藻株，本实验培养的HK128的总脂含量(24.83%)具有显著优势。

表2 在优化条件下第7天HK128的主要生化成分含量

进一步分析HK128的脂肪酸组成(见表3)，发现该藻株脂肪酸碳链长度主要集中在C4～C24之间。HK128的脂肪酸图谱基本与Chen等[31]研究的结果一致。其中棕榈酸(C16∶0)和α-亚麻酸(C18∶3n-3)是HK128的主要脂肪酸，相对含量分别为33.84%和32.48%，其次是相对含量为10.40%的顺-11-二十碳烯酸(C20∶n-9)和相对含量为8.05%的亚油酸(C18∶2)。一般来说，棕榈酸是最丰富的脂肪酸，在所有的微藻群中普遍存在。有研究表明，Dunaliellaprimolecta[32]和Phaeodactylumtricornutum[1]中棕榈酸含量分别为21.8%和21.63%。

表3 在优化条件下第7天HK128的脂肪酸组成(占总脂肪酸的百分含量)

杜氏藻中富含亚麻酸和亚油酸，Xie等[33]在150 μmol/(m2·s)光强下培养的Rhodomonassalina含有12.90%的α-亚麻酸和16.47%的亚油酸。Evans等[34]发现在10 d的连续光照条件下，D.tertiolecta中α-亚麻酸占总脂肪酸含量的34.7%。本研究中，HK128中α-亚麻酸占总脂肪酸含量的32.48%，但其生物量(3.6 g/L)显著高于已报道的Dunaliellatertio-lecta(0.46 g/L)和Dunaliellasp.(0.78 g/L)的生物量[35-36]。说明该藻株具有用于生产亚麻酸的优势。α-亚麻酸是维系人脑进化的核心物质，是保持人体健康的必需脂肪酸，具有增长智力、保护视力和抑制癌症转移等功效[7]。目前亚麻酸主要存在于深海鱼油和亚麻籽中，但是由于渔业资源日渐枯竭，亚麻籽生长环境苛刻、产量低，导致亚麻酸资源缺乏，亟需寻找新的亚麻酸生产原料。

本研究分离的藻株HK128是一株喜低盐度和高光强、耐高温及高pH的Dunaliellasp.。在温度为25 ℃，光暗周期为12 h∶12 h，初始pH=9.3，光强为200 μmol/(m2·s)条件下，在盐度20的Zarrouk培养基上进行优化培养，在培养的第7天HK128的生物量为3.6 g/L，总脂含量可为细胞干质量的24.83%，其中多不饱和脂肪酸α-亚麻酸占总脂肪酸含量的32.48%。由以上结果可以看出，HK128富含α-亚麻酸、生长速度快、生物量高，可作为生产α-亚麻酸的理想候选藻株,具有很大的开发潜力。

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