基于高分辨质谱技术的农药与生物大分子相互作用的分析方法
时间：2021-02-05 20:02:35 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要建立了检测农药小分子与生物大分子（BA蛋白，O酶）相互作用的高分辨质谱分析方法。对相应结合产物进行质谱检测，结果表明，BA蛋白与甲基对硫磷分子在开始相互作用 min后达到饱和，且每个蛋白分子最多与个甲基对硫磷分子结合；BA蛋白与甲维盐不存在相互作用。通过对O酶与敌敌畏，阿维菌素及噻呋酰胺结合产物的质谱检测发现每个O酶最多结合2个敌敌畏分子，1个阿维菌素分子，且不与噻呋酰胺相互作用。此外，实验表明，O酶与阿维菌素分子作用 min后达到平衡，与敌敌畏分子作用2 min后达到平衡。通过对两种蛋白结合农药小分子过程的时间分辨分析发现，两种生物大分子结合农药小分子的机理过程存在差异。本方法与相关标准方法（荧光光谱法，NB试剂盒法）及分子模拟对接结果比对说明，本方法切实可靠。本方法具有耗样量少、检测速度快、可提供多方面信息等优点，在新农药的研发及其安全性评价方面具有实用价值。
关键词高分辨质谱； 分子相互作用； 农药； 牛血清白蛋白； 超氧化物歧化酶
1引言
农药在确保粮食安全、农业稳产增收等方面发挥着重要作用，新农药的研发具有相当的社会价值和现实意义[1]。大部分农药为有机小分子，多通过特异性结合对应靶标蛋白抑制生物体的生理功能[2，]，进而达到除草、杀虫等目的。因此，研究农药与生物大分子的相互作用不仅对相关药理研究具有重要意义[，]，而且有望为新农药的研发提供理论基础和技术支撑。目前，基于核磁共振[6，7]、光谱[8～1]、圆二色谱[8]、分子模拟对接[9]等技术检测小分子与生物大分子相互作用已见诸报道，这些方法不同程度地存在样品消耗量大、耗费时间长等不足。鉴于此，本实验建立了用于监测农药生物大分子相互作用的高分辨质谱分析方法。通过对质谱检测条件的充分优化，实现了对农药生物大分子结合产物的质谱分析[112]，基于蛋白结合农药前后的质量数位移，确定单个蛋白分子所结合的最大农药分子个数，并最终区分是否存在相互作用。此外，还探索了农药与生物大分子相互作用的时间分辨分析，将所测结果与荧光光谱法[8～1]，NB试剂盒法[1]及分子模拟对接[9]等方法的结果进行了比对，本方法的可靠性获得了确证。
2实验部分
21仪器与试剂
Agilent 126高效液相色谱仪（UA）；622 OEIM质谱仪（UA）。荧光光谱仪，酶标仪（Bioek， UA），96孔板，移液枪。牛血清白蛋白（BA，纯度>98%，MW≈ 66 ka）；超氧化物歧化酶（O，纯度>9%，MW≈ 2 ka）；甲基对硫磷，甲维盐，阿维菌素，噻呋酰胺，敌敌畏（标准品）；NB试剂盒；乙腈，甲醇（德国默克公司）；甲酸（分析纯）；实验室用水为纯水仪（美国Millipore公司， UA）制备的二次蒸馏水。
22溶液的配制
准确称取198 mg BA于离心管，加入1 mL二次蒸馏水进行溶解（2 mmolL），于℃存放备用；称取11 mg O于离心管，加入11 mL二次蒸馏水溶解（ μmolL），然后分别稀释成和
2质谱检测条件
BA检测浓度：2 μmolL，质荷比采集范围：mz 9～2；O检测浓度： μmolL（样品先加1%甲酸酸化），质荷比采集范围：mz 8～18。离子源：EI，流动相：%乙腈%二次蒸馏水（含1%甲酸），进样量：2 μL，流速：2 mLmin。
结果与讨论
1BA蛋白和O酶的质谱检测
在优化的高分辨质谱条件下，实现了对BA蛋白和O酶的较好检测。由图1a可见，带+2到+6电荷的BA分子离子，带+9到+19电荷的O分子离子都能被检测到（图1b）。
2BA蛋白和O酶与农药小分子的相互作用
使用前述质谱方法对不同浓度的甲基对硫磷、甲维盐与BA蛋白之间的相互作用进行了评价。如图2a所示，当BA蛋白与甲基对硫磷作用 min后，可见其带有相应电荷碎片的质量数皆存在一定的位移，此位移值即对应所结合甲基对硫磷的质量数[1]。该位移值与所带电荷数的乘积与甲基对硫磷分子量的比值即为此状态下单个BA蛋白分子上所结合的甲基对硫磷的分子个数，约个。另一方面，BA蛋白与甲维盐充分孵育后，并未发生任何质量数的位移（图2b）。由此可判定BA蛋白与甲维盐不存在相互作用。
评价了O酶与阿维菌素、敌敌畏、噻呋酰胺的相互作用，相关数据参见表1，O酶与阿维菌素、敌敌畏结合后，检测出了带有十余个电荷的新的碎片离子，根据相应碎片质量数位移值最终确定此状态下单个O酶分子结合1个阿维菌素分子，2个敌敌畏分子，O酶与噻呋酰胺不存在相互作用。
综上所述，基于所建立之方法可通过检测蛋白与农药结合前后的质量数位移对是否存在相互作用进行判断，继而根据位移值以及相应农药分子的精确分子量计算得到单个蛋白分子所结合的农药分子个数，相关农药的质谱检测结果见表2。
BA和O与农药小分子相互作用的时间分辨分析
基于所建立的质谱方法探索了O酶与阿维菌素、敌敌畏结合过程的时间分辨分析。由图a可见，将浓度比为1∶的O酶与阿维菌素的混合液于2℃分别孵育，1，1，2，和 min后，结合农药的O酶的新的碎片峰离子强度不断变化，并于 min后趋于稳定。由此可见，O酶结合阿维菌素的过程在 min后趋于平衡。在对应的条件下O酶和敌敌畏的检测结果（图b）可见，两者结合产物对应的离子强度于2 min左右趋于稳定。由此判定，O酶与敌敌畏的结合于2 min左右趋于平衡。实验表明，O酶与阿维菌素、敌敌畏的相互作用过程中皆存在一个逐步趋近于饱和平衡的过程，此过程具有相对渐进发生、逐步达到平衡的特点。
BA蛋白甲基对硫磷混合液（1∶， VV）于7℃孵育后，通过检测结合产物的强度对此相互作用过程进行时间分辨分析。由图c可见，当孵育时间小于1 min，检测到BA蛋白与甲基对硫磷的结合产物离子强度为零，即稳定的相互作用产物尚未完全生成；随着孵育时间增长至1 min，产生位移；孵育时间继续增长，位移值保持不变。由图c可见，新的碎片峰的离子强度于2 min趋于稳定，即BA蛋白与甲基对硫磷的结合于2 min趋于平衡。结果表明，BA与甲基对硫磷的的结合与O结合相应农药分子的过程存在显著区别。由该曲线推测BA与甲基对硫磷结合过程中可能存在着某种协同准备阶段，当该过程结束后农药小分子会在较短时间内结合到对应蛋白的作用位点。这主要可能由于BA蛋白与O酶的分子空间结构的差异以及蛋白空腔作用位点个数的不同所致。
