RNA干扰的研究进展 环状rna研究进展

　　【摘 要】RNA干扰( RNAi) 是指内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股RNA在细胞内特异性地诱导同源互补的mRNA 降解, 从而阻断相应基因表达的现象。RNAi在生物界中广泛存在, 其发生过程主要分为3个阶段：起始阶段、效应阶段和扩增阶段。它在抵御病毒感染、维持基因组稳定、基因表达调控等方面发挥重要生物学作用。随着人们对RNAi研究的不断深入，RNAi技术作为基因沉默的一个工具，已被广泛用于基因功能研究、疾病的靶点治疗等方面的研究。
　　【关键词】RNAi；基因沉默；siRNA；基因治疗
　　【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455（2012）02-0031-02
　　
　　RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股RNA(small interfering double strand RNA, siRNA)诱导产生的一种转录后基因沉默(post2transcrip tional gene silencing, PTGS) 现象。它是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物、真菌、无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域。
　　1 RNAi的发现
　　1990年，Jorgensen等[1]将产生色素的基因导入矮牵牛中，试图加深花朵的颜色，结果很多花没有变成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。表明不仅导入的基因未表达，而且本身同源的基因失活。从而发现在转基因植物中存在基因表达的共抑制现象，即转入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出现基因沉默现象。后来发现在其它许多植物中也有类似的现象。首次发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫的研究。1995年康乃尔大学的Guo 和Kem-phues发现正义RNA 与反义RNA 一样能够阻断par-1基因的表达。1998年Fire等[2]证实，将制备的RNA高度纯化后发现，单链RNA的基因抑制作用很微弱，而用纯化后的dsRNA却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不但可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默，他们将这种现象称为RNAi。在随后的几年中, 研究者们发现RNAi 现象广泛的存在于真菌、水螅和斑马鱼等真核生物中。
　　哺乳动物的RNA干扰机制与低等生物并不完全一致[3]。在哺乳动物细胞中，将dsRNA转入哺乳动物体细胞内通常会激活双股RNA依赖的蛋白激酶和RNA酶L通路，结果导致被转染的细胞发生了非特异的蛋白质合成障碍并且诱导凋亡。最近研究表明，只要dsRNA 短于30bp，就以避免由较长的dsRNAs所带来的问题，表明siRNA可以在哺乳动物细胞中有效地诱发RNAi[4]。
　　2 RNAi的作用机制
　　近年的研究表明，虽然开始时细胞制造非常长的dsRNAs，但其最终被分解为21-25 bp长度的片段，形成siRNA后才真正诱导了RNAi[5]。siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基，此外，每条单链的3′端均有2-3个突出的非配对的碱基，可介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子。细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步,有数种合成方式可以产生dsRNA，其中通过转录相反的重复区合成发卡型mRNAs，或通过启动子分别合成互补的正义和反义股，然后退火形成siRNAs是最为经典的方式。
　　2.1 RNAi的作用过程
　　现在已初步阐明RNAi的作用机制，具体作用机制如下：(1)起始阶段，主要是siRNA的形成：在细胞质中内源或是外源的dsRNA(直链的或是发卡状的)与Dicer酶结合从而将dsRNA切割形成长度为20-30 bp的siRNA片段，这个过程需要ATP的参与。（2）效应阶段，主要是沉默复合物(RISC)的形成：siRNA与Argonaute 蛋白结合RNA诱导的沉默复合物RISC，RISC的激活需要ATP的参与。在siRNA反义链的指导下，激活的RISC与目的mRNA结合并对目的mRNA进行切割。试验发现目的mRNA上的切割点位于与siRNA中反义链互补的第一个核苷酸下游1l或12个核苷酸处。另外具有平齐末端的siRNA更能有效地引起RNAi作用。（3）扩增扩散阶段，即倍增放大机制：大量试验表明只需要极少量的siRNA就可以引发RNAi现象，因此推测在整个过程中存在倍增放大机制。RdRP是一种依赖于RNA的RNA聚合酶。在这个过程中它发挥了重要作用，但是目前仅在一些线虫、真菌和植物中发现了它的存在．因此它并不是真核生物中发生RNAi所必须的。不管是内源还是外源的siRNA都可以作为RdRP扩增的引物，目的RNA可以作为模板，在细胞内扩增dsRNA，由此产生的dsRNA再次被Dicer作用形成siRNA，进入下一轮循环，以此来使RNAi作用放大。
　　2.2 RNAi的必需基因
　　通过遗传分析的方法，目前已分离到线虫中RDE-2、RDE-3和Mut-7、果蝇中的ago2、拟南芥中的sgs-2、sgs-3、argonaute1(ago1)、sde1、sde3、caf、ddm-1、met-1等RNAi相关的基因。研究发现这些基因多数属于多基因家族，有很大的保守性。进一步研究发现，许多基因沉默必需蛋白与一些基因表达调控因子结构相似，如拟南芥的DDMI蛋白与染色体再构因子SW12/SNF2相似，线虫的RDE-1与翻译因子Eif-C结构相似[6-7]。这可能表明，基因沉默机制在生物的进化中有很大的保守性和多样性。 　　3 RNAi的生物学功能
　　3.1 RNAi抑制转座子活性
　　Ketting等[9]发现蠕虫mut-7基因参与RNAi并且与转座子的转座抑制有关[8]；而在果蝇中，参与RNAi的RNA解螺旋酶Spindle-E的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失。同时提高了反转录转座子活性。由此可见，RNAi参与转座子转座的抑制。
　　3.2 RNAi抵御病毒感染
　　RNAi在生物体抵御外来病毒的入侵方面有着重要的作用，可能是其最原始的生物功能之一。在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现，sgs2/sdel基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性[7]。而且在被病毒感染的植物细胞中，病毒通过自身进化的基因阻碍RNAi的产生。Novina等[11]合成分别针对HIV-1细胞受体CD4、病毒结构蛋白Cag基因的siRNAs，发现siRNAs能够有效抑制HIV-1进入细胞、HIV-1生活周期的整合前和整合后感染。
　　3.3 RNAi参与异染色质的形成和遗传
　　Hall等[12]研究表明，着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核。Mikel等[13]异染色质的遗传需要通过RNA干扰(RNAi),它引导细胞周期中DNA复制时组蛋白的改变，他们发现复制起源的交换重排和着丝粒周围的沉默RNA导致酵母菌Schizosaccharomyces pombe转录和复制之间的竞争，RNAi释放RNA聚合酶II(PolI)，允许通过主导链DNA聚合酶和打开带有复制叉的异染色质的相关组蛋白修饰酶来完成DNA复制，如果缺乏RNAi，停滞的复制叉通过同源重组而不是组蛋白修饰进行校正。
　　3.4 RNAi在干细胞增殖分化中的作用
　　研究提示ago1和zwille对于芽生组织中的干细胞具有重要的调控作用[14]。Zwille在芽生组织从胚胎发育到组织形成的过程中，为维持芽生组织中未分化的干细胞起关键作用。在芽尖分化时，Zwille像ago1一样诱导STM(shoot meristemless)基因的表达。而STM基因在整个发育过程中涉及茎端分生组织的结构建成，STM基因是芽生组织功能维持和启动分化所必需的。在Zwille突变的芽尖分生组织，尽管能正确的启动分化，但不能不对称分裂。
　　人类干细胞的研究发现人Agronaute家族成员Hiwi在原始造血干细胞表达，而在已分化的血细胞不表达[15]。可能Hiwi表达缺失与干细胞分化有关。
　　4 RNAi的应用
　　4.1 基因敲除
　　RNAi能使在体外培养的细胞达到基因敲除的效果, 对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因, 可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。如Van Brocklyn[16] 等应用RNA 干扰技术敲低神经鞘氨醇激酶( SphK1)表达, 显著减少恶性胶质瘤细胞系的增殖率；而且, 在敲低SphK2表达时更能抑制恶性胶质瘤细胞系的增殖。
　　4.2 基因功能的研究
　　借助RNAi技术可以迅速简便的干扰细胞中某个基因的表达，分析该基因缺失后对细胞产生的影响，从而研究目标基因的功能。有研究报道，设计laminBl、laminB2、NUPl53、GAS41、ARC21、cdkl等目的基因的siRNA，并在体外合成后将这些siRNA直接注入大鼠成纤维细胞、Hela细胞和3T3细胞中成功抑制了目的基因的表达，从而研究部分基因的功能[17]。
　　2005年人类基因组计划完成的基因图谱中人类大多数基因的功能还不清楚。而RNAi这种反向遗传学方法显示了在这方面的极大优势。Chia等[18]用一个整基因组RNAi筛选来鉴别hESCs中调整自我更新和多能特性的基因，筛选出了hESCs中具有多能性调节中功能的转录子PRDM14。Fraster等[19]利用RNAi技术分析了线虫I号染色体上80％以上的基因，并且发现了1 772个基因的RNAi表型。将siRNA注射到线虫胚胎后，筛选了Ⅲ号染色体上大约90％的基因，确定了其中133个基因是必须的，并分析了这些基因的功能。这两个试验为利用RNAi研究哺乳动物全基因功能的研究奠定了坚实的基础。
　　4.3 基因治疗
　　RNAi可以特异性的抑制基因表达，所以可用于基因病、病毒感染、癌症的治疗。作为基因治疗的工具, RNAi既高效特异, 又简便易行。近来人们把siRNA 技术引入到c-myc功能的研究中，通过体外合成的c-myc-siRNA抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的c-myc表达活性, 成功抑制了Jurkat细胞的增殖[20]。Zuber等[20]利用通过筛选靶向急性骨髓性白血病（AML）小鼠模型染色质调节子的shRNAs文库，鉴别出了Brd4蛋白是AML的关键因子，进一步使用shRNAs沉默Brd4，无论是体内还是体外实验都表现出了明显的抗病性。为此, 可以预测RNAi技术在不久的将来用于某种基因突变或过度表达所引起的疾病的基因治疗具有广阔和光明的前景。
　　5 RNAi的展望
　　人们对RNAi的研究只有短短的几年时间，但进展却极为迅速。可以认为RNAi是一个以小分子RNA为中心的真核细胞基因表达调控系统，它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化，通过对RNAi的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。在今后的研究中，RNAi 技术不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展，还有可能设计出RNAi 芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用RNAi 技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。
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