响应曲面法优化雷公藤农药用总生物碱的闪式双水相提取工艺
时间：2021-02-08 00:05:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要：以雷公藤总生物碱提取率为指标，采用乙醇-硫酸铵闪式双水相提取法对总生物碱提取工艺进行单因素及Box-Behnken响应曲面试验优化。结果表明，雷公藤总生物碱闪式双水相提取的最佳工艺条件为提取时间126 s、（NH4）2SO4用量0.41 g/mL、液料比24 mL ∶1 g、pH值3，此条件下得到的雷公藤总生物碱提取率为（19.01±008）%。该工艺科学、合理、可行，为杀虫活性物质雷公藤生物碱的产业化开发奠定了基础。
关键词：雷公藤；总生物碱；闪式提取；双水相；Box-Behnken响应曲面试验
中图分类号： TQ453.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0187-04
收稿日期：2017-03-29
基金项目：贵州省大学生创新创业项目（编号：201514440014）；贵州省教育厅教学改革项目（编号：2015QNXM08）。
作者简介：李 安（1989—），女，重庆人，硕士，讲师，主要从事天然产物开发及保健食品研究。E-mail：20140517@git.edu.cn。
通信作者：吴德智，博士，副教授，主要从事食品与药品研究开发。E-mail：47722068@qq.com。 雷公藤系卫矛科（Celastracese）雷公藤属植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）的根，在我国资源丰富，具有较好的药用和农用价值。其活性成分主要是二萜内酯类、生物碱类及三萜类化合物等，具有抗菌、抗炎、免疫调节等多种药理作用，可治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，临床应用广泛[1-2]。我国民间常利用雷公藤防治各种害虫，其主要杀虫成分为雷公藤总生物碱，对多种害虫具有较强的胃毒、拒食、麻痹、触杀和生长发育抑制等作用[3-8]。因此，雷公藤作为一种杀虫植物具有较大的研究开发潜力。
闪式提取法作为一种新的提取方法，利用适当溶剂在数秒至几分钟内将物料快速破碎至适当粒度，通过高速搅拌、超强振动、负压渗滤等功能实现提取[9]。闪式提取法具有操作清洗简单、维护方便的特点，且较短的提取时间使得能耗减少，降低了生产成本。目前闪式提取法的研究已涉及中药、食品、农副产品等领域，具有快速、高效、节能、环保等特点[10-11]，结合双水相提取，有更好的分离性能，且有利于醇类的回收[12-13]。因此，本研究以雷公藤总生物碱提取率为指标，通过单因素和Box-Behnken响应曲面试验优化闪式双水相提取工艺条件，对雷公藤农药的研究及开发具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雷公藤药材，购自福建汉堂生物制药股份有限公司；正己烷、无水乙醇等试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；雷公藤吉碱（自制，纯度大于98%），用面积归一法制得；甲醇（色谱纯），购自美国天地有限公司。
1.2 仪器与设备
JHBE-50T闪式提取器，购自河南金鼎科技发展有限公司；FA1004B电子天平，购自上海越平科学仪器有限公司；UV-2550 型紫外-可见分光光度计，购自梅特勒-托利多（中国）；HH-1智能数显电热恒温水浴锅，购自杭州大卫科教仪器有限公司；旋转蒸发器，购自上海上天精密仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 双水相体系的确定及闪式双水相提取雷公藤总生物碱工艺 准确称取100 g雷公藤根皮粉末（粉碎过100目筛），按试验要求加入适量的乙醇-硫酸铵双水相体系溶液，闪式提取。取上清液于60 ℃真空旋转蒸发回收溶剂，所得浓缩液真空干燥，得雷公藤总生物碱提取物。由前期预试验可知，当乙醇体积分数为40%、（NH4）2SO4用量为0.2～0.5 g/mL 时可以形成较稳定的双水相体系。因此，本试验固定乙醇的体积分数为40%，进行其他工艺参数的考察。
1.3.2 雷公藤总生物碱含量的测定[14]
1.3.2.1 标准曲线的绘制 精确称取适量雷公藤吉碱，加甲醇配制成浓度为304 μg/mL的对照品储备液。精确量取10、15、2.0、2.5、3.0、3.5 mL雷公藤吉碱对照品储备液置于 10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，在268 nm波长处测定其吸光度，得出以吸光度（D268 nm）为纵坐标、以雷公藤吉碱的浓度（x）为横坐标的标准回归方程为D268 nm=0.005 8x-0.008 73，r=0.999 2。雷公藤吉碱的浓度在 30.4～103.2 μg/mL 范围内线性关系良好。
1.3.2.2 供试品溶液的测定 取雷公藤生物碱提取物，用30 mL、0.5 mol/L HCl溶液提取3次，合并酸液，用30 mL三氯甲烷萃取酸水液2次，弃去三氯甲烷层，在酸水中加入浓氨水调节pH值约为7，静置，用滤纸过滤，加浓氨水调节pH值为9～11，再用90 mL三氯甲烷分3次萃取至水中无生物碱为止，合并三氯甲烷液，在旋转蒸发仪中浓缩至干，加入5%HCl溶液并定容至 25 mL，即得雷公藤總生物碱供试品溶液。
1.3.2.3 生物碱提取率的计算 于紫外分光光度计上测定各提取物溶液在268 nm处的吸光度，根据线性方程得到总生物碱含量，并按下列公式计算雷公藤药材中总生物碱的提取率：
总生物碱提取率=总生物碱含量（mg/L）×25 mL根皮粉质量（mg）×1 000×100%。
1.3.3 单因素考察闪式双水相提取工艺[9-10] 本试验针对提取时间（60、90、120、150、180 s）、（NH4）2SO4用量（0.2、03、0.4、0.5、0.6 g/mL）、液料比（12 mL ∶1 g、16 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、24 mL ∶1 g、28 mL ∶1 g）、pH值（1、2、3、4、5）4个因素，保持其中3个变量固定不变，对另一个变量进行单因素试验，以雷公藤总生物碱提取率为指标，确定Box-Behnken响应曲面设计所需的水平范围。试验设计如表1所示。
