改性壳聚糖的性质及对纤维素酶的固定效果
时间：2021-01-30 12:01:12 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要：采用改性壳聚糖作为载体研究改性壳聚糖作为固定化材料对纤维素酶吸附大小的影响。结果表明，当交联剂浓度达到4%时对改性固定化酶活性影响最大，改性壳聚糖固定化酶的最适pH值为4.3，改性壳聚糖作为载体的固定化纤维素酶米氏常数为3.7×10-3，未改性壳聚糖为载体的固定化纤维素酶的米氏常数为7.2×10-3，用改性壳聚糖作为载体的固定化纤维素酶最适温度为55 ℃左右。结果表明，改性壳聚糖作为载体固定化纤维素酶可以提高游离酶的性质。
关键词：纤维素酶；壳聚糖；固定化；改性
中图分类号： S188文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）10-0160-04
纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，具有广阔的开发利用前景，以纤维素酶为固化对象，通过试验比较化学改性与未改性壳聚糖固化酶载体，探索固化酶的制备方法与性质，旨在研究固化酶的最适条件，从而改善传统意义壳聚糖固定化纤维素酶的相关研究。甲壳类动物废弃的外壳中可以提取一种多糖——壳聚糖，学名为2-氨基-1，4-β葡聚糖，含有极其丰富的甲壳素（chitin）。壳聚糖的结构与纤维素类似，也是至今为止在自然界中被发现的唯一的阳离子型可食用纤维，对疾病有很好的保健和预防作用[1-4]。由于分子中存在氨基，使其易于酶共价结合，也可络合金属离子，化学性质较稳定，耐热性好，经常作为固定化酶的载体[5-8]。本试验通过采用化学方法改性壳聚糖固定化纤维素酶，改变壳聚糖的某些分子结构，探索相比未改性壳聚糖分子更优化的性质。
本研究采用简单的化学方法对壳聚糖进行了改性，并采用拉曼光谱和X光衍射分别测定了改性壳聚糖的部分性质。最后，研究了改性壳聚糖固定化纤维素酶的效果。
1材料与方法
1.1试验材料
纤维素酶，壳聚糖，氨基硫脲-壳聚糖改性产物，3，5-二硝基水杨酸染色液，羧甲基纤维素钠盐溶液，其他试剂均为分析纯。
1.2试验方法
1.2.1纤维素酶液的制备取1 g纤维素酶，加入1 000 mL蒸馏水，充分搅拌直至全部溶解，得纤维素酶液，4 ℃保存备用。
1.2.2羧甲基纤维素钠盐溶液的配制准确称取1.00 g羧甲基纤维素钠，用50 mmol/L、pH值为 5.0的柠檬酸钠缓冲液加热溶解后，转移到100 mL容量瓶中，待冷却后，用该缓冲液定容至刻度，4 ℃保存备用。母液A（0.2 mol/L柠檬酸溶液）：称取42.03 g C6H8O7·H2O 溶解稀释至1 000 mL；母液B（0.2 mol/L 柠檬酸钠溶液）：称取58.82 g Na3C6H5O7·2H2O 溶解稀释至1 000 mL；取20.5 mL母液A和29.5 mL母液B混合，调节pH值至5.0，稀释至200 mL，即得 50 mmol/L、pH值为 5.0的柠檬酸钠缓冲液。
1.2.3固定化酶活性测定
在一定量固定化酶中（一般取0.1～0.5 g）加入一定量（一般为3.0 mL）羧甲基纤维素钠盐溶液，40 ℃水浴保温10 min后离心5 min，吸取反应液 2.0 mL，加入0.4 mL 2 mol/L NaOH溶液，加入0.8 mL 3，5-二硝基水杨酸显色剂，定容至6.2 mL，沸水浴中加热5 min后流水冷却，在最适条件（40 ℃）下，1 min内催化1 μmol底物转化为产物所需的酶量定为1个活性单位，用721分光光度计在490 nm处测定吸光度[5]。
1.2.4壳聚糖改性产物的制备
壳聚糖乙酸溶液的制备[1]：将1 g壳聚糖在100 mL蒸馏水中浸泡润湿15 min，然后加入40 mL 2.5%的乙酸溶液，充分搅拌使其溶解，即得到壳聚糖乙酸溶液。
壳聚糖改性吸附剂的制备：称取3 g氨基硫脲置于 250 mL 烧杯中，加入100 mL蒸馏水，加热搅拌至50 ℃时，逐滴加入6 mL 25%的戊二醛溶液，并充分反应45 min。加入配制好的壳聚糖乙酸溶液，加热至70 ℃，充分反应30 min后，取出反应物，流水冷却，再分3次加入80 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，搅拌充分后，抽滤，用蒸馏水洗涤产物至滤液pH值为7.0，再用乙酸乙酯、无水乙醇分别洗涤后，放入真空干燥箱于60 ℃下至质量不再变化，最终获得淡黄色固体粉末状壳聚糖改性产物。
1.2.5纤维素酶的固定化
称取2 g改性壳聚糖，加入100 mL 6%的戊二醛，充分搅拌3.5 h直至溶解，静置24 h，3 000 r/min 离心5 min后弃去上清液，水洗2～3次以除去残余戊二醛，抽滤，往交联后的壳聚糖中加入1 g纤维素酶，室温下继续搅拌2.5 h，转入冰箱于4 ℃保存备用。静置24 h，3 000 r/min 离心5 min后弃去上清液，水洗2～3次，抽滤即得改性固定化酶；称取一定量的未改性壳聚糖作以上同样的处理，即得未改性固定化酶。
1.2.6酶活性的测定
葡萄糖含量的測定用3，5 - 二硝基水杨酸法，并作如下修改：1 mg/mL标准葡萄糖水溶液，浓度梯度终体积为4 mL，加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸准确煮沸5 min，流水冷却后于520 nm处比色，利用标准曲线计算产生的葡萄糖量，从而计算酶活性，以葡萄糖质量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。最后做出的标准曲线公式为 y=1.935 40x-0.062 05，r2=0.996 51。
2结果与分析
2.1拉曼光谱（Raman spectra）
拉曼光谱（Raman spectra）是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼（Raman）所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。
