中药学论文,减肥中药市场调查报告
时间：2020-07-20 13:22:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
本科毕业论文
正交设计法优选石榴皮中
总多酚的提取工艺研究
二级学院
中药学院
专
业
中药学（中药分析与鉴定方向）
班
级
学生姓名
学
号
指导教师
2018 年 4 月
诚
信
声
明
我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。
毕业论文（设计）作者（签名）：
年
月
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目
录
摘要 ......................................................................................................................... Ⅰ-Ⅱ 1 前言 ............................................................................................................................ 1 2 材料与仪器 ................................................................................................................ 3 2.1 试剂与试药 .............................................................................................................. 3 2.2 主要仪器 .................................................................................................................. 3 3 方法 ............................................................................................................................ 4 3.1 石榴皮总多酚含量测定方法 ................................................................................. 4 3.2 方法学考察 ............................................................................................................. 5 3.3 石榴皮中总多酚的提取工艺优化 ......................................................................... 6 4 结果 ............................................................................................................................ 7 4.1 石榴皮总多酚含量测定方法 ................................................................................. 7 4.2 方法学考察结果 ..................................................................................................... 7 4.3 石榴皮中总多酚的乙醇提取工艺优化结果 ....................................................... 10 5 讨论 .......................................................................................................................... 14 5.1 提取条件分析 ....................................................................................................... 14 5.2 石榴皮总多酚的显色条件分析 ........................................................................... 15 5.3 最大吸收波长选择 ............................................................................................... 16 5.4 正交试验结果分析 ............................................................................................... 16 5.5 其他 ....................................................................................................................... 16 6 结论 .......................................................................................................................... 17 参考文献 ...................................................................................................................... 18 综述 .............................................................................................................................. 20 致谢 .............................................................................................................................. 32
I 正交设计法优选石榴皮中总多酚的提取工艺研究
摘要 ：
目的 对石榴皮中总多酚的提取工艺进行研究，并运用正交设计法对其提取工艺进行优选，以获得最佳的提取工艺。
方法 以没食子酸为对照，选取磷钼钨酸法对其显色，用紫外分光光度法在 760nm 处测定总多酚的吸光度，再根据标准曲线法计算石榴皮中总多酚的含量。采用 L 9 （3 4 ）正交实验设计，以石榴皮中总多酚含量为考察指标，考察乙醇浓度、提取时间、乙醇用量、提取温度 4 个因素对总多酚提取的影响。
结果 最佳的提取工艺为固定超声波功率 100W，乙醇浓度为 30%，提取温度为 60℃，料液比为 1:30 （g·mL -1 ），提取时间为 40min。结论 该工艺经试验含量测定方法简便、准确、重复性好，提取工艺经济、合理，值得进一步推广，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
关键词 ：
石榴皮；总多酚；紫外可见分光光度法；正交设计法
II Study on the Extraction Process by Orthogonal Design of Total Polyphenols in Pomegranate Peel
Abstract: Objective Study on the extractive process of polyphenols quantities and using the orthogonal experimental design method to select the best one. Methods Used gallic acid as a control matter selected the phosphomolybdic tungstic acid to carry out its color determined the absorbance at 760nm of polyphenols by using the ultraviolet spectrophotometry then calculated the total quantities of polyphenols according to standard curve method. By using the L 9 (3 4 ) orthogonal experimental design,method to carry out the experiment and the total polyphenols in the pomegranate peel as a factor observing the ethanol concentration,extractive time,ratio of raw material to solvent and extractive temperature.Results The optimum extraction condition was as follows ultrasonic power of 100W,30% ethanol,extraction temperature of 60℃,ratio of raw material to solvent of 1:30(g·mL -1 ),extraction time of 40 minutes. Conclutions The content determination method is simple,accurate and reproducible.Extraction which is technology,reasonable and economy worths of
further promotion and to the further development,it has good reference value.
Keywords: pomegranate peel;total polyphenols;ultraviolet spectrophotometry; method orthogonal experimental design
1 1
前言
石榴皮(Punicagmnate Peel)系石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮，秋季果实成熟，果皮开裂时采摘，去除种子及隔瓤，晒干或微火烘干。石榴皮是包裹在石榴果实外层的外皮，占石榴的20%~30%，大小不一，厚 1.5~3mm，为不规则的片状或瓢状。外表面红棕色、棕黄色或暗棕色，略有光泽，粗糙，有多数疣状突起，有的有突起的筒状宿萼及粗短果梗或果梗痕。内表面红棕色或黄色，有隆起呈网状的果蒂残痕。质硬而脆，断面黄色，略显颗粒状。作为传统中药，在《中国药典》（2010 年版）第一部记载：“性酸、温、涩；具有涩肠止泻、止血、驱虫等作用。用于久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带、虫积腹痛”。
石榴，别名安石榴、榭榴、丹若、金庞、海榴、甘石榴、天浆、若榴等，原产于伊朗及阿富汗等中亚地区，现在主要分布在亚热带及温带地区。据史书《博物志》记载：“汉张骞出使西域，得涂林安石榴种以归，名为安石榴”。在中国至今已有 2000 多年栽培历史，常被人们誉为“天下奇果，九州名果”。石榴果皮和根皮可入药，且是印染和制革工业的原料。我国目前已形成了河南荥阳和开封、陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自和新疆叶城 8 大石榴主产区，栽植面积达 64668hm 2 ，居世界首位，产量达 38 万多吨 [1] 。
随着石榴越来越受到人们的喜爱，石榴已经成为我国重点发展的水果之一，国内外学者对石榴皮的研究也越来越多。有文献报道 [2] ，1929 年，Emanuele Flaccomio分析了新鲜石榴果皮的成分，石榴皮含鞣花单宁10.4~21.3%，蜡0.8%，树脂 4.5%，甘露醇 1.8%，糖 2.7%，树胶 3.2%，没食子酸 4%等。1963 年，S．Rajadurai 等 [3] 人又从石榴皮中分析出异斛皮甙和石榴皮碱。1995 年，云南省农科院生物技术研究所 [4] 对蒙自石榴皮的氨基酸组分进行了分析，石榴皮含有多种氨基酸。另外，一系列的实验研究表明石榴皮有凝集精液和体内抗免生育的作用，对生殖器疱疹病毒、淋球菌和白色念珠菌有明显的抑制和杀灭作用，而且没有副作用 [5] 。因此，石榴皮在避孕、控制和治疗性传播疾病方面很有发展前景 [6] 。Saito 等 [7] 从日本上千种药用植物中筛选具有抗氧化能力的可食用植物，结果表明石榴皮提取物列第一，检测表明其抗氧化活性与多酚含量相关。石榴中多酚物质
2 主要分布于石榴皮中，约为 10.4%~21.3% [8] 。
石榴皮多酚是一类具有多酚羟基化合物的总称，主要包括鞣质类（水解鞣质）和黄酮类化合物（黄酮醇、黄烷醇、花色苷）等。石榴皮其他的化学成分有甾体类和三萜类、甘油三酯、有机酸和酚酸、脂肪酸和生物碱类。石榴皮多酚作为石榴皮中一种重要的生理活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗突变、抗癌和降血脂等生物学功效，在食品、医药和化妆品等领域有巨大的应用价值 [9-11] 。
石榴皮多酚提取方法各异，有直接煎熬提取法，微波提取法，超声波提取法，超临界流体萃取法等，王玲等 [12] 探讨了石榴皮多酚的最佳超声提取工艺条件为：目数为 60~80 目，提取功率为 385W。料液比 1:25，提取时间 120s，提取三次，多酚得率高达 21.4%。郭晓萍等 [13] 采用煎熬法提取石榴皮鞣质的工艺为：抽提比1:40，温度 90℃，时间 40min，鞣质的含量为 17.3%。姜萍等 [14] 采用超临界 CO 2萃取，得到萃取条件为：温度 44℃，压力 25Mpa，乙酸乙酯为夹带剂，萃取时间120min，得率能到 57. 83%。石榴皮总多酚的测定一般是采用分光光度计法，张茜等 [15] 采用的 Folin-酚法对石榴皮提取物中多酚的含量进行测定，以没食子酸的量为对照品。
近年来，随着人们对石榴皮营养保健价值的认识，石榴皮的研究成为热点。我国的石榴资源十分丰富，种植面积不断扩大，石榴的综合利用尚有很大的空间，而石榴皮除部分药用外几乎都被丢弃，这造成很大的资源浪费。目前，国内外对石榴皮的研究均主要集中在有效成分的抗氧化作用及其产生的药理活性、药效及作用机制方面。但是，对于石榴皮中多酚类成分（含量为石榴皮干质量的 10%~ 20%）的制备工艺方面的研究极少。而且前期药效试验也已证明，石榴皮多酚含量与其生物活性呈明显的正相关性。为了合理利用这部分废弃资源，更好地开发、利用石榴皮中的多酚，笔者采用紫外-可见分光光度法，以没食子酸为标准品，对石榴皮中的多酚进行含量测定，正交试验优选石榴皮总多酚最佳的制备工艺进行研究，以期为与石榴皮相关的保健食品的研究及资源开发提供理论依据和检测手段。
3 2
材料与仪器
2.1 试剂与试药
没食子酸对照品 中国药品生物制品检定所（批号：MUST1-13040103）
石榴皮药材 产自山东（20140302）、广东（20110901）、湖北（20131201）
钨酸钠
天津市科密欧化学试剂有限公司（批号：20130110）
钼酸钠 天津市永大化学试剂有限公司（批号：20110615）
磷酸 天津市富宇精细化工有限公司（批号：20111130）
盐酸 广州化学试剂厂（批号：20140111）
硫酸锂 天津市福晨化学试剂厂（批号：20130317）
30%过氧化氢 广州化学试剂厂（批号：20140501-1）
无水碳酸钠 天津市诺克科技发展有限公司（批号：20130106）
乙醇 天津市富宇精细化工有限公司（批号：20080728）
超纯水 实验室自制 2.2
主要仪器
KQ3200DE 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 UV1102 紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司 AUY 型电子天平 岛津（中国）有限公司 CP225D 型电子天平（分度值：0.01mg）
德国 Sartorius 公司 GZX-9246MBE 电热恒温鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 TC-15 套式恒温器 海宁市新华医疗器械厂 WS70-1 型红外快速干燥器 巩义市予华仪器有限责任公司
DFY-300 摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司
4 3 方法
3.1 石榴皮总多酚含量测定方法
3.1.1
总多酚含量的测定
采用磷钼钨酸法 [16] ，以没食子酸为标准品。
福林试剂(FC 试剂)的配制：在 1000mL 的圆底烧瓶内加入 50g 钨酸钠、12.5g钼酸钠、350mL 蒸馏水，85%的浓磷酸 25mL 及浓盐酸 50mL，充分混匀，加热回流 10h，再加入 15g 硫酸锂，15mL 双氧水，然后开口继续煮沸 15min，待双氧水完全挥发，呈亮黄色。冷却后定容至 500mL，过滤，滤液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中，此液放置于冰箱中备用。
3.1.2
标准品溶液的制备
取没食子酸标准品约 7mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至 50mL，得浓度为 0.1446 mg·mL -1 的对照品储备液Ⅰ。同法制备对照品储备液Ⅱ，没食子酸的浓度为 45.11mg·mL -1 。
3.1.3
供试品溶液的制备
取石榴皮粗粉约 0.5g，精密称定，加 40%乙醇溶液 15mL，50℃超声处理30min，滤过，滤液稀释至 50mL，再取 1mL 稀释至 20mL，作为供试品溶液。
3.1.4
选择测定波长
精密吸取 0.5mL 的对照品储备液Ⅰ置于 25mL 的棕色容量瓶中，加蒸馏水至 10.0mL，然后分别加入福林试剂 0.5mL，混匀，在 0.5~8min 内加入 1.5mL20% Na 2 CO 3 溶液，充分混合后定容，作为对照品溶液，30℃避光放置 1.5h 后置于 1cm的比色皿中，以缺对照品溶液作为空白对照，照分光光度法（中国药典 2010 年版附ⅣA）
[17] ，在 200~800nm 范围内扫描，分析扫描出来的图谱，找出没食子酸对照品的最大吸收波长。
精密吸取 1.0mL 供试品液于 25mL 的棕色容量瓶中，按上显色法操作，找出石榴皮总多酚的最大吸收波长。
结合两者的最大吸收波长确定测定波长。
5 3.2
方法学考察
3.2.1
标准曲线的绘制
分别精密吸取 0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 的对照品储备液Ⅰ，置于 25mL 的棕色容量瓶中，加蒸馏水至 10.0mL，然后分别加入福林试剂 0.5mL，混匀，在 0.5~8min 内加入 1.5mL20%Na 2 CO 3 溶液，充分混合后定容，作为对照品溶液，30℃避光放置 1.5h 后置于 1cm 的比色皿中，以缺对照品溶液作为空白对照，在选出的最大吸收波长（λ 为 760nm）处，测定吸光度，每个样品平行测定 3 次，并绘制标准曲线。
3.2.2 精密度试验
取石榴皮粉末约 0.5g，精密称定，按“3.1.3”项下供试品制备的方法，制备供试品溶液，于 760nm 波长处，按照标准曲线测定吸光度的方法，测定吸光度，平行测定 6 次。
3.2.3
稳定性试验
取石榴皮粉末约 0.5g，精密称定，按“3.1.3”项下供试品制备的方法，制备供试品溶液，于 760nm 波长处，分别在 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5h 时，按照标准曲线测定吸光度的方法，测定吸光度。
3.2.4
重复性试验
取石榴皮粉末约 0.5g，6 份，精密称定，按“3.1.3”项下供试品制备的方法，制备供试品溶液 6 份，于 760nm 波长处，按照标准曲线测定吸光度的方法，测定吸光度。
3.2.5 加样回收率试验
取已知含量的供试品粉末（总多酚的含量为 183.9mg·g -1 ）9 份，每份约为0.5g，精密称定，分别加入对照品储备液Ⅱ，按“3.1.3”项下供试品制备的方法，制备供试品溶液每个浓度 3 份，逐一测定吸光度。
3.2.6 样品含量测定
取三批石榴皮粉末各 3 份，每份约为 0.5g，精密称定，按“3.1.3”项下供试
6 品制备的方法，制备供试品溶液 6 份，于 760nm 波长处，按照标准曲线测定吸光度的方法，测定吸光度，并计算石榴皮中总多酚的含量。
3.3 石榴皮中总多酚的提取工艺优化
3.3.1 石榴皮总多酚的乙醇提取单因素试验
（1）提取温度的选择 固定乙醇浓度为 40%，料液比为 1:30，超声提取 30min，研究不同提取温度（50℃，55℃，60℃，65℃，70℃）对石榴皮总多酚提取效果的影响。
（2）乙醇浓度的选择 固定料液比 1:30，50℃超声提取 30min，选择 10%，20%，30%，40%，50%不同浓度乙醇溶液作溶剂，研究不同浓度的乙醇对石榴皮总多酚提取效果的影响。
（3）提取时间的选择 固定乙醇浓度为 40%，料液比为 1:30，50℃超声提取，研究不同超声提取时间（20min，30min，40min，50min，60min）对石榴皮总多酚提取效果的影响。
（4）料液比的选择 固定乙醇浓度为 40%，50℃超声提取 30min，研究不同比例的料液比（1:30，1:40，1:50，1:60，1:70）对石榴皮总多酚提取效果的影响。
3.3.2
石榴皮总多酚的乙醇提取正交试验设计
根据单因素试验结果，以乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间为主要考察因素，以测得样品总多酚的提取率为主要考察指标，按表 3-1 的正交因子水平L 9 （3 4 ）设计正交试验，每个试验平行做三次（每次试验中干燥的石榴皮粉末的用量约 0.5g，均精密称定），以确定最佳提取条件。
表 3-1 石榴皮总多酚的提取工艺因素水平表 水平 因素 A 乙醇浓度（%）
B 提取温度 （ ℃ ）
C 料液比（g·mL
-1 ）
D 提取时间 (min) 1 2 3 20 30
40
50 55 60 1 : 30 1 : 40 1 : 50 30 40 50
7 4
结果
4.1 石榴皮总多酚含量测定方法
4.1.1 测定波长的选定
在 200~800nm 范围内扫描波长得到没食子酸标准液的最大吸收波长为761nm，与 760nm 处相近，而样品的最大吸收波长为 760nm，且文献亦有用 760nm作为最大吸收波长，故而选定 760nm 为测定波长。
4.2 方法学考察结果
4.2.1
标准曲线的绘制结果
取对照品系列溶液，以不含没食子酸的空白溶液为参比，于 760 nm 处测定吸光度值 A，以总多酚吸光度值（A）为纵坐标，总多酚对照品溶液浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。石榴皮总多酚测定结果见表 4-1，绘制标准曲线结果见图 4-1。用最小二乘法作线性回归，得回归方程为 A=1.133×10 -1
C+6.400×10 -3 ，相关系数 r=0.9996(r>0.9990)。实验结果表明，没食子酸在 1.157~8.098μg·mL -1 浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。
表 4-1 石榴皮总多酚标准曲线测定结果
浓度(μg·mL -1 ) 吸光度
1.157 2.314 3.470 4.627 5.784 6.941 8.098 0.132 0.264 0.407 0.535 0.666 0.800 0.912
8
图 4-1 总多酚含量测定标准曲线（以没食子酸为标准）
4.2.2
精密度试验结果
仪器精密度试验结果见表 4-2，吸光度的 RSD 为 0.12%（n=6），表明仪器的精密度良好。
表 4-2 仪器精密度试验结果（n=6）
编号 吸光度值 平均值 RSD（ % ）
1 2 3 4 5 6 0.423 0.423 0.423 0.424 0.424 0.423
0.423
0.12
4.2.3 稳定性试验结果
稳定性试验结果见表 4-3，由结果计算得总多酚的吸光度值为 0.425，RSD 为0.61%（n=6），表明供试品溶液在 2.5h 内稳定。
表 4-3 稳定性试验结果（n=6）
时间（h）
吸光度值 平均值 RSD（ % ）
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.422 0.426 0.429 0.424 0.423 0.423
0.425
0.61
00.10.20.30.40.50.60.70.80.910.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000浓度C（μg·mL -1 ）吸光度（A）
9 4.2.4
重复性试验结果
重复性试验结果见表 4-4，由结果计算得样品总多酚含量的平均值为 185.0 mg·g -1 。重复性试验 RSD 为 0.97%（n=6），表明方法的重现性较好，方法可行。
表 4-4 重复性试验结果（n=6）
编号 吸光度值
总多酚含量（ mg·g -1 ）
平均值 （ mg·g -1 ）
RSD （ % ）
1 2 3 4 5 6 0.420 0.429 0.424 0.427 0.431 0.425 182.2 186.5 184.0 185.5 187.2 184.7
185.0
0.97
4.2.5 加样回收率试验结果
加样回收率试验结果见表 4-5，加样回收率试验数据显示，总多酚（以没食子酸计）的平均回收率为 99.80%，RSD 为 1.2%（n=3），符合分析要求。
表 4-5 加样回收率试验结果（n=3）
编号 取样量 （g）
样品含量 (mg) 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率（%）
平均值（%）
RSD （%）
低
中
高 0.250 5 0.250 8 0.250 9
0.250 4 0.250 3 0.250 2
0.250 7 0.250 9 0.250 4 68.76 68.98 68.76
91.04 91.70 90.38
113.8 112.9 112.4 22.55 22.55 22.55
45.11 45.11 45.11
68.67 68.67 68.67
22.69 22.85 22.61
44.99 45.67 44.37
67.67 66.75 66.40 100.6
101.3 100.3
99.70
101.2 98.40
100.0 98.60
98.10
100.7
99.78
98.92
0.54
1.4
0.98
4.2.6 样品含量测定结果
含量测定结果见表 4-6，三个批次石榴皮中总多酚的含量分别为 183.9mg·g -1 、198.3mg·g -1 和 226.9mg·g -1 ，RSD 分别为 0.01%，0.01%和 0.01%，符合要求。
10 表 4-6 样品含量测定结果（n=9）
批号 称样量 （g）
吸光度值
总多酚含量 （ mg·g -1 ）
平均值 RSD （ % ）
20140302
20110901
20131201 0.5004 0.5001 0.5003
0.5005 0.5003 0.5002
0.5004 0.5005 0.5003 0.422 0.427 0.421
0.457 0.458 0.453
0.524 0.519 0.520
183.3 185.6 182.9
198.7 199.2 197.0
228.2 226.0 226.5
183.9
198.3
226.9
0.01
0.01
0.01
4.3 石榴皮中总多酚的乙醇提取工艺优化结果
4.3.1
石榴皮总多酚的乙醇提取单因素试验结果
（1）提取温度的选择结果 提取温度的试验结果见表 4-7，图 4-2，在其他因素不变的情况下，石榴皮总多酚提取含量随着提取温度的升高而变化，其中 50℃~60℃为提取总多酚含量的最佳范围。
表 4-7 提取温度的选择 编号 提取温度 (℃)
总多酚含量（ mg·g -1 ）
1 2 3 4 5 50 55 60 65 70
183.4 202.9 186.8 179.8 176.5
11
图 4-2 提取温度对石榴皮总多酚提取效果的影响
（2）乙醇浓度的选择结果 乙醇浓度的试验结果见表 4-8，图 4-3，在其他因素不变的情况下，刚开始随着乙醇浓度的增加，石榴皮总多酚的得率也增加，乙醇浓度 20%~40%为提取总多酚的最佳范围。
表 4-8 乙醇浓度的选择 编号 乙醇浓度 (%)
总多酚含量（ mg·g -1 ）
1 2 3 4 5 10 20 30 40
50 173.2 176.0 185.3 182.9 179.8
图 4-3 乙醇浓度对石榴皮总多酚提取效果的影响
160.0170.0180.0190.0200.0210.01 2 3 4 5编号总多酚含量（mg· g-1 ）165.0170.0175.0180.0185.0190.01 2 3 4 5编号总多酚含量（mg· g-1 ）
12 （3）提取时间的选择结果 提取时间的试验结果见表 4-9，图 4-4，实验结果表明，在其他因素不变的情况下，随着提取时间的延长，石榴皮总多酚的得率呈增大趋势，提取时间30min~50min 为提取总多酚的最佳范围。
表 4-9 提取时间的选择 编号 提取时间 (min)
总多酚含量（ mg·g -1 ）
1 2 3 4 5 20 30 40 50
60 180.5 183.1 186.5 186.0 185.9
图 4-4 提取时间对石榴皮总多酚提取效果的影响
（4）料液比的选择结果 料液比的试验结果见表 4-10，图 4-5，在其他因素不变的情况下，石榴皮总多酚提取含量随着料液比的增加而降低，料液比 1:30~1:50 为提取总多酚的最佳范围。
表 4-10 料液比的选择 编号 料液比 总多酚含量（ mg·g -1 ）
1 2 3 4 5 1 : 30 1 : 40 1 : 50 1 : 60 1 : 70 183.5 158.8 130.8 107.5 106.1 176.0178.0180.0182.0184.0186.0188.01 2 3 4 5编号总多酚含量（mg· g-1 ）
13
图 4-5 料液比对石榴皮总多酚提取效果的影响
4.3.2
石榴皮总多酚的乙醇提取正交试验设计结果
石榴皮总多酚的乙醇提取正交试验的试验结果见表 4-11。
表 4-11 石榴皮总多酚的提取工艺正交试验结果分析 试验号 A 乙醇浓度 B 提取温度 C 料液比 D 提取时间 总多酚含量（ mg·g -1 ）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 k 1
k 2
k 3
K 1
K 2
K 3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 444.5 444.7 508.3 148.2 148.2 169.4 21.20 1 2 3 1 2 3 1 2 3 475.2 428.4 493.7 158.4 142.8 164.6 6.18 1 2 3 2 3 1 3 1 2 539.5 459.8 398.0 179.8 153.3 132.7 47.17 1 2 3 3 1 2 2 3 1 452.6 480.4 464.4 150.9 160.2 154.8 3.93 171.5 138.6 134.4 148.9 108.8 187.0 154.9 181.1 172.3
由表分析可知：石榴皮粉末在超声提取时，4 种因素最佳组合为 A 2 B 3 C 1 D 2 ，即乙醇浓度为 30%，提取温度为 60℃，料液比为 1:30，提取时间为 40min。在此条件下进行重复试验，重复试验平均值为 187.4 mg·g -1 ，RSD 为 0.10%，与预测值较为接近,说明采用正交设计法得到的工艺参数可靠,具有一定的实用价值。
0.050.0100.0150.0200.01 2 3 4 5编号总多酚含量（mg· g-1 ）
14 根据极差分析，本实验四个因素的主次关系是 C＞A＞B＞D，即料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间，说明料液比对总多酚得率的影响最大，提取时间影响最小。
5
讨论
5.1
提取条件分析
5.1.1 提取温度的影响
温度对于细胞内物质的溶出起着重要作用，温度过低，溶出速率慢，效率低，但温度过高，对于热敏性物质的性质产生影响，同时能量消耗大。本实验中，刚开始随着提取温度的升高，石榴皮总多酚的得率也增加，提取温度为 55℃时总多酚得率最高。这是由于随着温度升高，分子运动速度加快，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，从而促进了原料中石榴皮总多酚的溶出，使得多酚得率得以提高。当温度继续上升，石榴皮中总多酚得率呈现下降趋势，原因可能是多酚类物质的稳定性较差，长时间受热发生氧化或水解反应，使提取出来的多酚含量反而更低。因此，最佳提取温度是 55℃。
5.1.2 溶剂浓度的影响
由于石榴皮多酚结构中含有多个羟基，极性较大，可溶于水、乙醇、丙酮等亲水性有机溶剂。然而，甲醇和乙醇作溶剂时多酚得率相差不大，且乙醇的安全性高，成本低，来源广，易回收，因此本实验选用乙醇作为提取溶剂，并对其浓度进行考察。
植物体内多酚常与蛋白质多糖等大分子通过氢键、疏水键等形成复合物，乙醇浓度过大或过小都可降低石榴皮总多酚的提取得率。这主要是由于石榴皮多酚的成分很复杂，兼有脂溶性和水溶性成分，根据“相似相溶”原理，合适的乙醇体积分数才有利于有效成分最大化地溶出。乙醇浓度过低时，水含量高，不能破坏多酚与大分子之间的键，多酚提取的得率不高；研究表明，在中等极性溶剂中多酚类提取的得率较高；乙醇浓度过高，会造成脂溶性成分浸出增加，影响多酚的提取，进而降低多酚的得率。
15 其中，浓度为 30%乙醇溶液提取出石榴皮总多酚含量最高。
5.1.3 提取时间的影响
浸提时间长短直接影响提取效率的高低，浸提时间短，可以提高效率，但可能提取率低；提取时间过长，生产效率低，且多酚易氧化而受损。实验中，提取时间增大，石榴皮总多酚的得率也随着增加，提取时间为 40min 时总多酚得率最高，但超过 40min 时，总多酚得率反而下降。这是因为，超声波对细胞壁有破坏作用，在一定提取时间范围内，提取时间越长，越有利于多酚物质的释放，但若提取时间超过这个范围，浸出的多酚物质，在溶液中被氧化，导致提取率降低。因此，提取时间不宜超过 40min。
5.1.4 料液比的影响
料液比是影响原料中多酚提取的重要因素之一。适当的料液比既可使原料中的多酚类物质得到充分提取，还可减少溶剂的消耗及回收成本。实验中，石榴皮总多酚提取含量随着提取溶剂体积的增大，提取量反而呈线性下降趋势，原因可能是其他不良物质的溶出抑制了多酚类物质，使提取量反而降低。料液比的选择应综合考虑有机溶剂的节省以及对石榴皮总多酚提取率的影响，最终选择 1:30作为最佳料液比例。
5.2
石榴皮总多酚的显色条件分析
多酚是一类复杂的具有沉淀蛋白质性质的水溶性多元酚类化合物，见光分解，所以本实验应避光操作。多酚的经典含量测定方法有很多种，如重量法、容量法、比色法等，最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合量法。皮粉法是国际公认的多酚含量测定方法。
《中国药典》一部多酚含量测定法一直沿用皮粉法，由于该法专属性不强，皮粉用量大，实验周期长，已不适用于日常分析测定。通过实验证明，采用紫外分光光度比色法，测定总多酚含量专属性强，实验周期短，测定结果稳定，重现性好。如田树革用 Folin-Ciocalteu 比色法测定石榴不同部位总多酚的含量 [18] ，其主要原理是因为碱性条件下，多酚物质能与加入试剂中的亚铁离子发生反应，生成紫蓝色的络合物，性质比较稳定，因此用紫外分光光计就可测得吸光度值。本实验选用磷钼钨酸法，该法较络合滴定法、高锰酸钾法具有精密度高、重现性好、回收率高、操作简便、快速等优点，是测定石榴皮中总多
16 酚的一种好方法。
5.3
最大吸收波长选择
取对照品溶液经显色处理后，以磷钼钨酸法所加入的显色试剂加蒸馏水定容至 25mL 为空白，将待测液盛于比色皿中，置于比色池中，在 200~800nm 波长段扫描，确定最大吸收波长。结果显示，供试品在 761nm 处有最大吸收，而对照品在 760nm 处有最大吸收，与在 761nm 处的吸光度相差不大，故选择 760nm 为测定波长。
5.4 正交试验结果分析
极差 R 的结果表明，乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间 4 因素对石榴皮总多酚提取含量的影响的显著性为：料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间。石榴皮总多酚超声提取的最优水平搭配为 A 2 B 3 C 1 D 2 ，即乙醇浓度为 30%，提取温度为 60℃，料液比为 1:30，提取时间为 40min。恰当的提取时间和合适的提取温度可使石榴皮总多酚的溶出率更高。
5.5
其他
5.5.1
粉碎度的确定
试验过程中发现，细粉的提取效率略高于粗粉，这是因为，粒径减小意味着药材完整的细胞结构被破坏，细胞内的有效成分更容易提取出来，但提取过程中易产生暴沸，造成危险，不利于操作。故在药材粉碎时，要注意过筛好药材粉末，在尽量破坏其细胞结构，使石榴皮粒径尽可能地小的同时，石榴皮应该具有必要的机械结构性能，以保证溶剂在粒子与粒子之间渗透良好，以便于操作。此外，不同一批粉碎的药材，对实验结果的影响也比较大，故在粉碎药材时，应尽可能的增大粉碎量，以确保药材粉末能完成整个实验，从而减少误差。
5.5.2
实验环境的影响
实验过程中发现，若实验进行的环境变化较大时，如晴天与阴天、潮湿与干燥的天气，对实验的结果影响较大。故在开展实验前，应考虑到天气等方面的问题，计划好实验的进程，以减少不必要的误差。
17 6
结论
多酚类化合物广泛存在于自然界植物中，临床应用广泛，为了综合开发利用石榴皮资源和解决环境污染问题，本实验建立了石榴皮中总多酚含量测定方法和对样品进行测定。本次实验测定石榴皮总多酚含量时，选用测定总多酚常用的没食子酸作为对照品。
由单因素试验和正交试验的直观分析结果可知，从总多酚这一指标看，因素C（料液比）的影响最大，差异性显著，其次是 A（乙醇浓度）的影响，提取时间的影响最小。石榴皮总多酚的最佳提取工艺为乙醇浓度为 30%，提取温度为60℃，料液比为 1:30，提取时间为 40min。本实验优选出的工艺简单，操作容易、方便，且稳定性好，且超声提取法具有耗时短、节能、提取效率高等优点，作为中药有效成分提取的新方法，具有广阔的应用前景，为石榴皮总多酚的进一步研究提供了初步科学依据。
石榴皮中多酚化合物不易分离，而且很容易被还原，使测定结果不精确。想要找到一种方便、实用、结果又准确的测定方法，不仅要在提取分离纯化上下功夫，还要加强对各种组成物质基本的物理化学特性进行更进一步的研究。此外，石榴皮总多酚的成分很复杂，仅以没食子酸为对照品无法测定出全部的石榴皮总多酚，测定结果只是水解多酚的含量，所以对石榴皮中总多酚含量的测定还有待进一步研究。相信随着研究的深入,石榴皮将更好的造福于人类。
18 参考文献
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20 综述
石榴皮总多酚的提取研究进展
石榴皮(Punicagmnate Peel)系石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮。石榴皮是包裹在石榴果实外层的外皮，占石榴的 20%~30%，大小不一，厚 1.5~3mm，为不规则的片状或瓢状。外表面红棕色、棕黄色或暗棕色，略有光泽，粗糙，有多数疣状突起，有的有突起的筒状宿萼及粗短果梗或果梗痕。内表面红棕色或黄色，有隆起呈网状的果蒂残痕。质硬而脆，断面黄色，略显颗粒状。作为传统中药，收载于《中国药典》。石榴皮性酸，味苦涩，有涩肠止泻、止血、驱虫等功效，主要治疗细菌性痢疾、阿米巴痢疾和多种感染性疾病。
石榴皮也是石榴加工的副产物，其中含有很大成分的多酚含量，在干石榴皮中大约占 10%~30%左右，多酚独特的化学结构赋予了其独特的生理活性。多种研究表明，多酚具有抗肿瘤、抑菌及抗病毒、抗心脑血管疾病、抗氧化和延缓衰老等生理活性 [1-3] 。石榴皮多酚已在食品、医药和化妆品领域获得广泛应用。
本文主要对石榴皮总多酚及其提取研究的国内外研究现状进行综述。
1 石榴皮总多酚
石榴皮总多酚是石榴皮中多酚羟基化合物的总称，包括鞣花单宁、没食子单宁、鞣花酸、没食子酸、儿茶素、花色素、绿原酸、阿魏酸和栎精等多种化合物，占干重量的 10%~20%，研究表明其具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗突变、降血压和润肤美容的作用，在食品、医药和日用化学品等领域有巨大的应用价值。
1.1
植物多酚
植物多酚（Plant Polyphenol），又称植物单宁，最早是 Haslam 提出的。它是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，在维管植物中仅次于纤维素、边纤维素、木质素，广泛存在于植物的皮、根、茎、叶、果中，含量可达 20%。植物多酚是一类源自于植物体内的天然大分子化合物，人类对其认识和利用具有悠久的
21 历史，从远古时代开始应用于制革、治病和染色，到近现代大量用于石油开采、木材加工、水污染处理、医药、食品、化妆品等多个领域。植物多酚的研究越来越受到重视，关于植物多酚的生理活性的研究是近年来多酚研究的热点之一。常见的含多酚物质较多的植物超过 600 多种，我国拥有大量的多酚资源，其中石榴就是其中含多酚含量较多的植物之一，特别是在石榴皮中。随着人们对石榴多酚的认识，国内外学者对石榴多酚的研究报道也越来越多。石榴中含有多酚类化合物，黄酮类化合物，生物碱，有机酸和类雌激素成分等，而多酚类化合物占其中主要部分。
多酚的种类很多，目前已经分离鉴定了 8000 多种多酚类物质 [4] 。按结构可分为酚酸类（phenolic acids）、类黄酮类（flavonoids）及 1，2-二苯乙烯（stilbenes）和木酚素类（lignans）。酚酸类在植物中的含量十分丰富，最常见的是咖啡酸（caffeic acid），其它如阿魏酸（ferulic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）等。类黄酮又分为黄酮类（flavones）、二氢黄酮类（flavanones）、黄酮醇类（flavonols）、黄烷醇类（flavanols）、异黄酮类（isoflavonoids）、花色素类（anthocyanidins）、原花色素类（proanthocyanidins）。1，2-二苯乙烯类化合物在植物中的分布并不十分广泛，最常见的为白藜芦醇，化学名为 3，4，5-三羟基-1，2-二苯乙烯（3，4，5-trihydroxystlbene）。葡萄酒中含有较多的白藜芦醇 [5] 。木酚素类物质最早在人类的血浆和尿液中发现，后来在亚麻植物中发现。人类营养中主要的膳食木酚素来源是谷物及其他富含纤维的食物，在一些谷物中木酚素含量范围在 2~7 mg·kg -1[6] 。
1.2 石榴多酚
石榴是富含多酚的水果之一，不同部位所含的多酚种类和数量也不同。石榴中多酚的种类主要为鞣质类化合物、酚酸和黄酮类化合物等。
1.2.1
鞣质类化合物
鞣质类是石榴中最普遍的一类酚类物质，其中以可水解鞣质类为主，结构形式多样，在不同部位鞣质类化合物分布有所不同。据报道 [7-8] ，石榴汁中的主要鞣质成分有没食子酸、安石榴林和安石榴苷；石榴皮中的鞣质含量高，主要为安石榴林和安石榴苷。除此之外，已报道的成分还有没食子酸、没食子酰双内酯、鞣花酸、鞣云实精、英国栋鞣花酸、石榴皮亭 A、石榴皮亭 B、木麻黄宁、特里马
22 素Ⅰ、二鞣花酸鼠李糖基（1-4）吡喃葡萄糖营、5-O-galloyopunicacotein D、2，3-（S）-六羟基联苯二甲酰基-D-葡萄糖等。
1.2.2
黄酮类化合物
目前，从石榴中分离得到的黄酮类成分主要有黄酮、黄酮醇、花色素、黄烷-3-醇类等 [9-10] 。果皮和果汁中含有大量的花色素类化合物。在果汁中含有 6 种花色素类化合物，其种类和含量随着果实的成熟程度而发生变化。在成熟早期，以天竺癸素、矢车菊素和飞燕草素的 3，5-二葡萄糖苷为主，其中飞燕草素 3，5-二葡萄糖苷是主要成分。随着果实的成熟，单糖苷的含量不断增加，最后超过二糖苷，后期的主要成分为矢车菊素衍生物。果汁中除了 6 种花色素类成分外，还有芦丁、槲皮素、儿茶素、儿茶酚、山萘素和原花青素等化合物。果皮中含有天竺葵素和矢车菊素衍生物、槲皮素、异槲皮苷、山萘素、表儿茶素和原花青素等化合物。石榴籽种皮中则含有飞燕草色素、矢车菊素的单糖苷和二糖苷、山萘素、儿茶素和表儿茶素等化合物。
1.2.3 酚酸类化合物
石榴酚酸类化合物主要有咖啡酸、绿原酸、新绿原酸、原儿茶酸、阿魏酸、邻-香豆酸、对-香豆酸。李建科等 [11] 利用高效液相色谱测得，石榴汁中含有原儿茶酸、绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、没食子酸等酚酸化合物。石榴皮中含有原儿茶酸、没食子酸、绿原酸、咖啡酸等酚酸化合物。石榴籽中含有没食子酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸化合物。
2 石榴皮多酚提取方法
多酚物质的提取方法一般有热水提取法、溶剂提取法、碱性稀醇或碱性水提取法、超声波辅助提取法、微波提取法、超临界 CO 2 流体萃取法、超高压流体萃取法和生物酶解提取法等。在石榴多酚的提取过程中，根据不同的要求与条件，选择适宜的提取方法将有助于提取效率的提高和提取效果的增强，从而获得较高的提取率和产品纯度，得到理想的实验效果，为后续实验创造有利的条件。
23 2.1
溶剂提取法
溶剂提取法是天然产物活性成分提取中广泛采用的工艺，其原理是，根据植物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分的溶解度小的溶剂，将活性成分从植物组织内溶解出来的方法 [12] 。当溶剂加入到植物原料中时，溶剂由于扩散，渗透作用通过细胞壁透入细胞内，溶解有效物质，将所需成分大部分溶出 [13] 。一般溶剂提取法的操作步骤是将提取剂加入到粉碎的石榴皮、花等组织中，在一定温度下，浸提一定时间，过滤后得滤液，即粗产品。滤液可进一步加工，如上吸附树脂等，得到高纯度的产品。
目前，多酚的浸提方法主要是有机溶剂提取法，常用的有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，这些有机溶剂对多酚都有良好的溶解能力，不与多酚物质发生化学反应，且浸出杂质少、易于分离。选择有机溶剂时，可以根据主体酚类的含量、酚类分子量进行选择，亦可调节溶液的 pH 值来控制萃取物的组分。该方法在实际操作中主要考虑的因素有：提取溶剂的选择、料液比、提取温度、提取时间以及浸提次数等。
贾冬英等 [14] 采用体积分数为 20%的乙醇做溶剂，料液比 1:20，在 50℃条件下提取 1h，多酚得率达 22.86%，取得了很好的效果；孙兰萍等 [15] 亦采用 50%的乙醇作为提取溶剂，在料液比 25:1，70℃条件下提取 1.5h，石榴皮多酚得率达16.28%；王晓瑜等 [16] 通过预实验采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水分别对新疆石榴皮总多酚进行提取，结果多酚得率是甲醇＞乙醇＞水＞乙酸乙酯。由于甲醇和乙醇作溶剂时多酚得率相差不大，并且三种溶剂中乙醇的安全性最高，价格最为低廉，来源广，回收率高，因此选用乙醇作为提取溶剂。由此可见，石榴皮多酚的提取在提取溶剂的选取上，乙醇备受青睐。
溶剂提取法是石榴多酚非常成熟的提取工艺，具有成本低、对活性物质选择性强、易操作控制等优点，在工业上获得了广泛应用。但存在着安全性低、耗时长、提取率低和污染大等缺点。近年来，国家对环境污染不断加大治理，溶剂提取法有逐渐被淘汰的趋势。
2.2
微波辅助提取法
微波辅助提取法是利用微波能来提高提取率的一种新型、高效的提取方法。
24 微波是频率在 0.3~300GHz 之间，波长在 30cm 和 1mm 之间的电磁波。物料经微波加热，内部温度升高、压力增大，当压力达到一定程度时，原料物细胞发生破裂，细胞内的欲提取物质溶入提取溶剂中；再者，微波产生的电磁志加速了被萃取成分由物料内部向萃取溶剂界面的扩散速率，从而缩短了萃取时间 [17-18] 。一般工艺流程是将乙醇加入原料中，再置于微波反应装置中处理，最后过滤即得产品。微波提取的影响因素主要包括溶媒、微波辐射剂量、功率和提取时间等。
王玲等 [19] 通过单因素试验和正交试验确定微波辅助法提取石榴皮多酚的最佳提取工艺条件为：提取功率为 385W，料液比为 1:25（W/V），提取时间为 120s，提取次数为 3 次。在此条件下，石榴皮多酚得率最高达 21.4%。李志洲等 [20] 利用响应面法优化提取石榴皮中多酚类物质的提取工艺条件，采用微波辅助提取石榴皮多酚时发现，以 80%乙...
