[湖北省水稻条纹叶枯病的发生与检测] 水稻条纹叶枯病
时间：2020-03-10 07:17:18 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要：由灰飞虱（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）持久传播的水稻条纹病毒（ＲＳＶ）引起的水稻条纹叶枯病在我国长江中下游粳稻种植区造成严重的损失。２０１１年，在湖北省孝感市一种植粳稻品种嘉优２号的田块中发现约１０％的植株呈现典型的水稻条纹叶枯病症状，分子检测证实发病植株病原物为ＲＳＶ，ＰＣＲ产物ＴＡ克隆并测序进一步证实了发病植株病原物为ＲＳＶ。灰飞虱能在湖北省越冬，并能传播水稻条纹叶枯病，因此，ＲＳＶ对该区的粳稻种植存在潜在的威胁，应及早采取应对措施。
关键词：ＲＳＶ；ＲＴ－ＰＣＲ；粳稻；湖北省
中图分类号：Ｓ４３５．１１１．４＋９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5101-03
Occurrence and Detection of Rice Stripe Virus in Hubei Province
ＹUAN Ｂｉｎ１，ＺHANG Ｓｈｕ１，Ｌ?� Ｌｉａｎｇ１，ＹANG Ｘｉａｏ－ｌｉｎ１，ＣHANG Ｘｉａｎｇ－ｑｉａｎ１，ＬIU Ｈｕａ－ｌｉｎ２，ＹU Ｄａ－ｚｈａｏ１
（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４；
２． Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｘｉａｏｇａｎ，Xiaogan 432000，Hubei，China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ， ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔ ｈｏｐｐｅｒ （Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）， ｈａｓ ｃａｕｓｅｄ ｓｅｒｉｏｕｓ ｙｉｅｌｄ ｌｏｓｓ ｏｆ jａｐｏｎｉｃａ rｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｒｅａｃｈｅｓ ｏｆ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｒｉｖｅｒ． Ｉｎ ２０１１， １０％ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ infected by ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ａ ｒｉｃｅ ｆｉｅｌｄ ｔｈａｔ ｐｌａｎｔｅｄ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｊｉａｙｏｕ２ ｉｎ Ｘｉａｏｇａｎ， Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． ＲＴ－ＰＣＲ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ， ａｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ， ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｉｎｄｅｅｄ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＲＳＶ． Ｉｔ ｈａｓ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＲＳＶ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｅａｔ ｆｏｒ ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｅａ， ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ａｄｏｐｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｔｉｍｅｌｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄs： ＲＳＶ； ＲＴ－ＰＣＲ； jａｐｏｎｉｃａ rice； Hubei province
２０１１年，在湖北省孝感市一块处于分蘖初期的粳稻品种嘉优２号田发现约１０％的植株生长不正常，有的植株部分叶片呈黄绿色，有的植株心叶有黄绿色条斑，有的条斑从基部沿叶脉向叶尖蔓延，有的条斑向下蔓延到叶鞘，有的植株心叶呈黄色枯萎卷曲下垂形成枯心，部分植株已经枯死，呈现典型的水稻条纹叶枯病症状。推测可能是由ＲＳＶ（Ｒｉｃｅ sｔｒｉｐｅ vｉｒｕｓ）引起的病毒病――水稻条纹叶枯病。该病毒病在水稻全生育期均可以发生，是水稻的一种毁灭性病害，迄今尚未见湖北省水稻条纹叶枯病发生的相关报道。
水稻条纹叶枯病病原属纤细病毒属（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ），该属病毒具有独特的基因组结构，病毒粒体由４种ｓｓＲＮＡ和单一外壳蛋白组成。ＲＳＶ只侵染禾本科植物，由灰飞虱（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ Ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）以持久性方式传播，可以在昆虫体内增殖，能经卵传给后代［１］。为确定病田发生的病害是否由ＲＳＶ引起，从田间取样带回实验室进行分子检测。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
在发病稻田取具备典型水稻条纹叶枯病症状的病株１２株和无症植株２株作为样品，进行病原物分子检测。
１．２ 试验方法
１．２．１ 总ＲＮＡ的提取 采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ＲＮＡ，参照操作手册进行。各取叶片约２５０ ｍｇ，置于１．５ ｍＬ离心管中，离心管浸入液氮中冷却，用预冷的研棒在离心管中研磨，直至样品变成粉末；加入１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ，剧烈摇匀，室温放置５ ｍｉｎ，使其充分裂解；１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，弃沉淀；加入２００ μＬ氯仿，振荡混匀后室温放置１５ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心１５ ｍｉｎ，吸取上层水相至新离心管中；加０．５ ｍＬ异丙醇混匀，室温放置５～１０ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心１０ ｍｉｎ，弃上清液，ＲＮＡ沉于管底；加１ ｍＬ ７５％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；８ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心５ ｍｉｎ，弃上清液；在超净工作台上吹干５～１０ ｍｉｎ；用ＤＥＰＣ处理并用高压灭菌的５０ μＬ ｄｄＨ２Ｏ ５５～６０ ℃ ５～１０ ｍｉｎ溶解ＲＮＡ样品。抽提的ＲＮＡ置于－２０ ℃冰箱备用。
１．２．２ ＲＳＶ 病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测 利用嵇朝球等［２］设计的特异检测ＲＳＶ的两对引物Ｃ１：５′ ＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＡＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣ ３′，Ｃ２：５′ ＣＧＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＧＣＣ ３′和Ｓ１：５′ ＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＧ
ＧＴＡ ３′，Ｓ２：５′ ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＧＴＥＴＴＧＴＧＴＡＧ
ＡＡＧＡＧＧ ３′进行分子检测，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。采用两步ＲＴ－ＰＣＲ进行鉴定。测定抽提的ＲＮＡ浓度，依据各样品的浓度取１ μｇ ＲＮＡ置于０．５ ｍＬ的离心管中；加入１ μＬ １０×反应缓冲液和１ μＬ ＤＮＡａｓｅ，补ｄｄＨ２Ｏ到１０ μＬ，３７ ℃处理１５ ｍｉｎ，６５ ℃灭活１０ ｍｉｎ，置于冰上５ ｍｉｎ；加１ μＬ １０ μｍｏｌ／μＬ ９ ｂｐ随机引物，６５ ℃变性１０ ｍｉｎ，置于冰上５ ｍｉｎ；加入反转录酶、ｄＮＴＰ等混合液，３７ ℃水浴４５～６０ ｍｉｎ，６５ ℃灭活１０ ｍｉｎ。取１ μＬ反转录产物为模板进行ＰＣＲ扩增，反应程序依照嵇朝球等［２］的方法进行，琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后照相。
１．２．３ ＲＴ－ＰＣＲ产物的克隆和序列比较 利用生工生物工程（上海）有限公司生产的回收试剂盒回收ＣＰ和ＳＰ的扩增产物，以Ｐｒｏｍｅｇａ公司的ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ系统ＴＡ克隆目的片段，挑阳性克隆抽质粒ＡＢＩ ３７３０测序。
２ 结果与分析
２．１ 病株的病原物检测
利用Ｔｒｉｚｏｌ法抽提发病田１４个植株样品和１个健康样品（取自武汉试验田）的ＲＮＡ，采用ＲＴ－ＰＣＲ方法分别检测ＲＳＶ的ＣＰ和ＳＰ基因。发病田块１４个样品均扩增出位于１ ０００ ｂｐ附近的ＣＰ基因目的带，同时也检测到位于５００ ｂｐ上部的ＳＰ基因目的带（图１），而健康样品和ｄｄＨ２Ｏ中没有扩增出任何产物。这个结果表明孝感市发病田发生的病害是由ＲＳＶ引起的。值得注意的是，孝感市发病田的２株无症植株也检测到目的带，但比有明显症状的病株目的带要弱，可能是由于植株体内病毒含量低以至于症状不明显。这显示发病田实际的ＲＳＶ感染状况比田间观察到的要严重。
２．２ ＲＳＶ基因组部分序列比对
将上述ＰＣＲ扩增产物分别ＴＡ克隆并测序（图２）。用获得的序列分别在ＮＣＢＩ中做ＢＬＡＳＴ，获得的ＣＰ序列检索结果表明其与已发表的ＲＳＶ Ｒ３序列（登录号ＦＪ６０２６８６）有９９％的序列同源性；获得的ＳＰ序列检索结果表明其与已发表的ＲＳＶ Ｒ４序列（登录号ＥＵ９３１５１３）同样有９９％的序列同源性。测序结果进一步证实孝感市发病田发生的水稻病害确实是由ＲＳＶ引起。
３ 讨论
根据田间症状及病原物分子检测，确认孝感市粳稻种植田块发生的病害为水稻条纹叶枯病，该病目前在湖北省发生面积较小。该病毒危害的特点是：有着广泛的寄主，能够侵染小麦、大麦、玉米等８０多种禾本科植物［３］，其中对水稻的危害最为严重，发病严重的田块病株率高达５０％，产量损失２０％～３０％，严重的甚至绝收；一般水稻条纹叶枯病的发生直播田重于移栽田、早栽田重于迟栽田、人工移栽田重于机插秧田、土质差的田块重于土质好的田块；粳稻发生较重，籼稻较少发生［４］。传播ＲＳＶ的灰飞虱能够在本地越冬导致该病成为常驻病害，以至于发生范围逐步扩大，发生程度逐年加重。
３．１ ＲＳＶ对湖北省水稻生产的潜在威胁
水稻是湖北省种植面积最大、总产最高的农作物，占粮食总播种面积的５０％以上、总产７０％左右、商品量８０％［５］。近年来，随着人们生活水平的提高，对大米品质要求也随之提高，特别是优质粳米越来越受到人们欢迎。湖北省于１９９９年推出了发展优质农产品的农业“四优”工程，其中首要的就是发展优质稻米［６］， 而扩大优质粳稻种植面积是提高米质的重要途径之一。２０世纪９０年代，水稻条纹叶枯病在江苏发生并暴发成灾，蔓延至整个长江中下游稻区，仅２００４年江苏省有４２个县发生水稻条纹叶枯病，面积达１５７万ｈｍ２，占水稻总栽培面积的７９％，绝收面积达５ ２００ ｈｍ２，成为水稻生产上最主要的病害之一［７］。
根据粮食区域规划，湖北省在江汉平原、鄂东北、鄂北等水稻主产区推广优质晚粳新品种，扩大粳稻种植面积帮助农民增收。分析表明ＲＳＶ对湖北省粳稻种植存在潜在的威胁：①湖北省粳稻未进行抗ＲＳＶ育种，推广品种也未做抗ＲＳＶ鉴定。这次孝感市发生ＲＳＶ田块种植粳稻品种是浙江育成的嘉优２号，田间调查有约１０％的植株发病，ＲＴ－ＰＣＲ检测结果显示无症植株也带有ＲＳＶ。研究显示大部分粳稻品种对ＲＳＶ感病，籼稻基本对ＲＳＶ抗病［７］。长期以来，湖北省以籼稻种植为主，粳稻种植面积不大，随着粳稻种植面积的扩大，ＲＳＶ可能成为湖北省水稻种植的威胁。近年来，与湖北交界的河南多次发生严重的ＲＳＶ危害也说明了这一点［８］。②与迁飞进入湖北的褐飞虱和白背飞虱不同，作为ＲＳＶ的持久传播介体灰飞虱能在本地越冬，在湖北省可以发生５～６代，４月中旬就进入早稻秧田为害［９］。鉴于ＲＳＶ不能通过种质传播，所以孝感发生的ＲＳＶ是由本地灰飞虱带毒传播的。值得注意的是，发病田块以及周边田块灰飞虱的数量极少，推测本田的病株是从秧田带入，表明ＲＳＶ在当地已经成为常驻病害。③地处华中的湖北省是小麦、玉米和水稻混栽区，而这三者都是ＲＳＶ的寄主，种植期和生育期各不相同有利于ＲＳＶ的传播。小麦是冬春作物，与水稻种植季节衔接，易成为ＲＳＶ的越冬寄主，所以ＲＳＶ一旦在湖北流行将造成小麦、玉米和水稻的严重损失。
３．２ 应对ＲＳＶ病害威胁的措施
针对ＲＳＶ对湖北粳稻种植潜在的威胁，建议加强ＲＳＶ在湖北的流行病学研究，调查灰飞虱在湖北的分布、发生情况、当前气候下以及当前耕作制度下的消长关系，并检测其带毒率。当前应采取以下措施提前预防水稻条纹叶枯病的发生：①对湖北省内推广的粳稻品种进行抗ＲＳＶ鉴定，明确哪些品种是抗病品种，哪些品种是感病品种，为品种合理布局提供依据。②加强省内粳稻抗ＲＳＶ育种工作，使得新推出的品种具有抗ＲＳＶ的能力。③充分利用分子生物学技术创建抗ＲＳＶ新种质［１０］。
目前生产上采取措施进行综合防治是必需的：①稻田的合理布局，在小麦－水稻轮作区，水稻秧田要远离小麦地，避免灰飞虱从小麦上传播ＲＳＶ到秧田。②避免将不同生育期的水稻种植在一起，形成“插花”。③近年来，江苏等地育成了一批抗ＲＳＶ的粳稻品种，适当引进适合湖北省种植的品种以限制ＲＳＶ的蔓延。④做好灰飞虱的防治工作。
参考文献：
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