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    分子标记及其应用 SSR分子标记在花生上的应用

    时间:2020-03-05 07:32:53 来源:雅意学习网 本文已影响 雅意学习网手机站

      摘要综述了近年来SSR 技术在花生遗传图谱构建、遗传多样性分析、分子标记辅助育种、亲缘关系鉴定等方面的应用情况,从而为相关研究提供参考。   关键词SSR分子标记;花生;应用
      中图分类号S565.2;Q789文献标识码A文章编号 1007-5739(2011)11-0021-02
      
      ApplicationofSSRMolecularMarkerinPeanut
      SUN Yu-tongHU WeiSHI Yong-qinSHEN Qi
      (College of Agriculture,Nanjing Agricultual University,Nanjing Jiangsu 210095)
      AbstractThe research progress on the SSR molecular marker applied to genome mapping,identification of genetic diversity,marker-assisted selection in peanut breeding,relationships and germplasm distinction in recent years were reviewed,thus provided reference for related study.
      Key wordsSSR molecular marker;peanut;application
      
      花生(Arachis hypogaea L.)是植物油和植物蛋白质的重要来源,经济价值较高。栽培花生是异源四倍体(2n=4X=40,AABB),其在形态、生理、农艺性状等方面存在着丰富的变异,而在DNA分子水平上揭示的多态性较少[1]。目前,花生DNA分子标记研究明显落后于其他作物,Hopkins 等[1]首先筛选出6对多态性SSR引物,这些SSR引物在花生栽培品种中检测到的多态性高于此前报道的其他所有分子标记,从此建立在花生微卫星序列信息基础上的分子标记技术发展极为迅速,目前已设计出可利用的花生SSR标记800多对,其在花生遗传育种中的应用也越来越广泛。现就微卫星标记技术的原理及其在花生上的主要研究进展进行概述。
      1SSR的基本原理及特点
      1.1SSR标记的原理
      SSR(Simple Sequence Repeats)标记即微卫星标记,是由1~6个核苷酸为单位串联重复而成的DNA序列,长度一般在200 bp以下,两端为较保守的单拷贝序列。由于重复序列数目不同或重复程度不完全相同而呈现多态性,呈孟德尔式遗传,共显性。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计位点专一的引物,利用PCR 技术扩增每个位点的微卫星序列,扩增产物经聚丙酰胺凝胶电泳分离、显色后,比较谱带的相对迁移距离,分析核心序列的长度多态性。
      1.2SSR标记的特点
      目前,在所应用的几种代表性的分子标记中,RFLP标记对DNA质量要求高,且分子杂交时会用到放射性同位素,对人体有害,其探针的制备、保存和发放也不方便,而且分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高,多态性程度偏低[2];RAPD标记受许多因素影响,试验的稳定性差。另外,RAPD对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg浓度,因此试验的重复性差[3];AFLP技术过程复杂,涉及诸多步骤,试验过程中不论哪个环节出现问题,都不会得到理想的结果。此外,AFLP技术试验成本较高,且受专利保护[4]。与其他分子标记相比,SSR具有以下优点:一是数量丰富,多态性高,检测程序简单;二是共显性遗传,不易被自然选择和人工选择所淘汰,符合孟德尔遗传定律[5-6];三是保守性,SSR 位点两侧的序列具有高度的保守性,在等位基因中多相同,便于重复利用已知引物;四是易于利用PCR技术分析,对DNA 质量要求低,用量少,仅需微量组织便能有效地分析鉴定;五是费用低,易于检测、重复性好、便于自动化分析,同时可进行多位点的检测。SSR具有高度多态、共显性、保守性、DNA需量少、操作简便、重复性好、稳定可靠等优点,已广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、分子标记辅助育种等方面的研究。
      2SSR标记在花生上的应用
      2.1花生遗传图谱构建
      遗传图谱(Genetic Map)又称遗传连锁图谱(Genetic Linkage Map),是指以染色体重组交换率为相对长度单位,以遗传标记为主体的染色体线状连锁图谱[7]。构建遗传图谱不仅能了解基因的组成和结构,还能作为研究作物性状遗传、种质进化、基因克隆的工具。Moretzsohn等[8]利用野生品种A.duranensis和A.stenosperma 为亲本,构建了F2 群体。他们在433对SSR引物中筛选出204对在亲本间表现多态的引物,构建了1张花生的遗传连锁图,总长达1 230.89 cM,其中有170位点定位到11个连锁群中,这11个连锁群的长度在20.07~280.10 cM,平均每个标记之间的距离为7.24 cM。姜慧芳等[9]用抗青枯病花生品种远杂9102与感病品种Chico杂交,从F2起用单粒传法构建了花生重组近交系群体(RIL)F6和F7。采用354对SSR引物对重组近交系F6群体的基因组DNA鉴定,获得多态性标记45个。结合重组近交系群体F6和F7青枯病抗性鉴定结果,构建了栽培种花生部分遗传连锁图。图谱总长度为603.9 cM,含29个标记(28个SSR标记和1个表型标记)的8个连锁群,还有17个独立的SSR标记;获得了与青枯病抗性相关的SSR标记2个(7G02和PM137),位于该图谱的第1连锁群上,与青枯病抗性基因间的遗传距离为10.9 cM和13.8 cM,并且位于抗性基因的两侧,两标记间的距离为23.7 cM。洪彦彬等[10]以粤油13和阜95-5为亲本,通过杂交构建包含184个F6重组自交系的遗传作图群体。对652对genomic-SSR 引物和392对EST-SSR引物对亲本进行多态性检测,从中筛选出121对多态性引物,在亲本中共检测到123个多态性位点。利用作图群体对多态性SSR位点进行遗传连锁分析,获得包含108个SSR 标记(102个genomic-SSR标记和6个EST-SSR标记),涉及20个连锁群、总长568 cM、平均图距为6.45 cM的花生栽培种遗传图谱。
      2.2花生遗传多样性分析
      进行栽培和野生花生遗传多样性及亲缘关系的研究,对花生种质资源的收集、保存和育种工作都具有重要意义。SSR标记作为重复性稳定性高的共显性标记,在种内品种间多态性高,在基因组中分布广泛,很适合进行遗传多样性分析。Hopkins等[1]首先利用SSR标记对5个栽培品种的遗传多样性进行了研究。唐荣华等[11]从36对SSR引物中筛选出10对引物,能在24个珍珠豆型花生品种DNA 中扩增出多态性片段,每对SSR引物可扩增出1~6个DNA 片段,扩增位点数为2~11个,平均6.5个;多态性位点为1~11个,平均6.1个。根据SSR 标记分析24个珍珠豆型花生的遗传距离为0.04~0.69 cM,平均为0.37 cM。聚类分析将24个珍珠豆型花生品种划分为4个品种群。陈静等[12]利用10对SSR引物对参加我国北方区域试验的27个花生品种进行PCR扩增分析,共扩增出57条带,其中45条呈现多态,多态性比率为78.95%。27个品种间的遗传相似系数在0.311~0.962,平均为0.651。聚类分析结果表明,27个参试花生品种在遗传相似系数0.61处分为3个类群,同一类型的参试品种优先聚为一类,同一地区或同一育种单位提供的品种往往首先聚为一类。
      2.3花生分子标记辅助育种
      分子标记辅助育种(Marker Assisted Selection,MAS)是指把分子标记技术应用于育种过程中,利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术。姜慧芳等[9]从354对SSR引物中筛选出2个与花生青枯病抗性相关的SSR标记7G02和PM137,其与青枯病抗性基因的遗传距离分别为10.9、13.8 cM。王辉等[13]利用抗、感北方根结线虫病花生品种为亲本配制杂交组合花育22号×D099,以其F2分离群体为研究材料,采用SSR技术和BSA分析方法,获得了2个与花生北方根结线虫病抗性基因连锁的SSR分子标记S322380和S892140,其与抗病基因间的遗传距离分别为4.421、7.404 cM。洪彦彬等[14]选用100 对SSR 引物对12个抗感黄曲霉花生品种的基因组DNA 扩增,结果表明共有41对引物在不同品种间检测出2~4 个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.153~0.750。供试品种SSR 标记基因型与黄曲霉侵染指数间的关联分析表明有5个标记与抗性相关,其中标记pPGSseq19D9 与抗性关联度最高,Pearson 相关系数达0.913。进一步观察发现,pPGSseq19D9的扩增带型能直接区分抗感品种,初步推断pPGSseq19D9可能与1个贡献率较大的抗黄曲霉基因连锁。
      2.4花生亲缘关系的比较和鉴定
      利用形态指标进行植物分类时,易受环境影响而影响分类的准确性,且对于一些形态指标相近、性状较少的品种则难以区分。应用分子标记技术可以对花生的亲缘关系进行较全面的比较和鉴定。陈本银等[15]用44对SSR特异引物对花生属不同区组的21份种质进行了分析,获得能稳定揭示花生属种间差异的34对SSR引物。结果表明:21份材料间存在很大的遗传变异,平均遗传距离为0.63 cM,变异范围为0.08~0.95 cM。聚类分析表明,区组间的遗传分化大于区组内的遗传分化,匍匐区组的遗传分化大于其他区组的遗传分化,同一物种不同种质间也存在很大的差异。栽培种花生与花生区组材料的亲缘关系相对较近,与花生属的植物学分类一致,其中A 基因组的A.duranensis和A.villosa 及B基因组的A.batizocoi与栽培种花生的亲缘关系更近一些。唐荣华等[16]以5份花生栽培种资源和花生属6个区组的19 份野生种资源为研究材料,通过SSR 分子标记技术分析其DNA 多态性并进行聚类分析。结果表明,大多数花生SSR 引物为多位点引物,花生属种间种质存在丰富的DNA多态性,A.duranensis是花生栽培种(A.hypogaea L.)的野生种亲本之一,与花生区组野生种亲缘关系最近的是异形花区组,最远的是大根区组。周桂元等[17]对花生品种粤油14 及亲本共7份资源进行了SSR标记聚类分析。结果表明:粤油14与湛油12、汕油27、汕油71的亲缘关系最近,其次是粤油116、粤油367,亲缘关系最远的是印度花皮。
      2.5花生突变体分析
      我国花生辐射育种从20世纪60年代开始后,许多花生科技人员相继做了大量工作,但由于各种原因,较少开展突变分子机理的研究。近年来,对辐射诱变后代材料分子水平的研究始有报道,其中运用SSR标记进行分析的较多。周桂元等[18]用返回式卫星搭载花生品种粤油7号种子为材料,经过3年的地面种植和选择,获得21个变异株系。选用110对SSR引物对21个变异株系进行SSR多态性分析,有5对引物的扩增在变异株系与对照品种之间表现出多态性。苗华荣等[19]以60Coγ 射线辐照花生品种鲁花11号,通过调查其m?2代植株农艺性状,筛选到7个叶部特征明显变异的突变材料,利用107对SSR 引物对其进行分析。结果发现突变材料与原品种之间存在不同程度的多态性,且均呈现多个位点突变。分析表明,60Co辐照诱变可使花生的DNA分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异。陈静等[20]以辐照处理花生品种鲁花11 号m?2为材料,通过农艺性状调查筛选变异材料。利用107 对SSR 引物对7个有代表性的变异材料进行PCR 扩增,分析花生辐照诱变材料的SSR 遗传多态性。同时,将筛选到的多态性标记用于分析原品种和诱变后代材料间的遗传相似性。结果表明,诱变材料与原品种之间存在不同程度的多态性,且呈现多个位点突变; 60Co辐照诱变可使花生的DNA 分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异,并非单纯的点突变。
      2.6其他方面的应用
      SSR引物组合法在检测品种纯度上具有高效性和可靠性,在花生品种鉴定中也得到了应用。詹世雄等[21]以3对SSR引物对汕油21繁育种子60个样品进行种子纯度检测,共有2对标记引物检测到3个杂株样品,该批种子的纯度为95.0%;SSR标记在阐明物种进化关系的研究方面应用广泛。He等[22]利用珍珠豆型栽培种与花生区组二倍体野生
      (下转第27页)
      (上接第22页)
      种杂交产生的后代研究野生花生遗传物质渗入栽培种在分子方面的证据,研究认为杂交后代材料整合了野生亲本的遗传物质,并找到了野生亲本的特异微卫星标记(PM36 、PM305)的谱带。在某些杂种后代中也扩增出亲本所没有的DNA 条带,表明基因融合过程中发生了遗传物质的缺失或重组。
      3结语
      目前花生SSR标记的研究已取得了一定的进展,初步展现出其在花生连锁图谱构建、分子标记辅助选择、遗传多样性分析、亲缘关系比较等方面发挥的重要作用,但目前可利用的SSR标记还远远不能满足上述研究的要求,因此SSR分子标记的开发将是未来一段时间花生分子生物学研究的重点。随着文库构建技术的不断成熟、方法的改进,以及花生基因组测序计划的启动,花生SSR标记将会更加丰富,在花生中的应用前景也将更加广阔。
      4参考文献
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      注:本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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