甘薯根腐病【甘薯与根腐病相关AFLP标记筛选】
时间：2020-03-10 07:17:01 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要：甘薯根腐病是由甘薯根腐病病原菌［Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ（Ｍａｒｔ．）Ｓａｃｃ． ｆ． ｓｐ． ｂａｔａｔａｓ ＭｃＣｌｕｒｅ，简称ＦＳＢ］引起的一种真菌性毁灭性病害，传播途径广，蔓延速度快，近年有向长江流域以南地区传播的趋势，对甘薯生产造成极大危害。在已有的徐薯１８与胜利百号Ｆ１分离群体抗性鉴定的基础上，采用分离群体混合分析法（Bｕｌｋｅｄ sｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）与AFLP技术相结合，通过筛选８０对引物，定位与甘薯根腐病相关的分子标记，在感病群体中定位到一个显性标记，即标记Ｅｃｏ（４５）－Ｍｓｅ（４５）被发现与感病基因连锁。所获试验结果对甘薯抗病遗传改良具有指导意义。
关键词：甘薯根腐病；ＡＦＬＰ标记；分离群体混合分析法
中图分类号：Ｓ５３１；Ｑ３４３．１＋７ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5254-02
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＬＰ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ａ Ｌｏｃｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｉｄｅｎｃｅ ｔｏ Ｒｏｏｔ Ｒｏｔ ｉｎ Ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ
ＳＵ Ｗｅｎ－ｊｉｎ１，ＷＡＮＧ ｌｉａｎ－ｊｕｎ１，ＬＥＩ Ｊｉａｎ１，ＺＨＡＯ Ｔｉａｎ－ｙａｏ２，ＳＨＵＡＩ Ｑｉｕ－ｊü２，ＹＡＮＧ Ｘｉｎ－ｓｕｎ１
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＦＳＢ，ｉｔ ｈａｓ ｍａｎｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｙｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｅｄ ｉｓ ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ，ｉｔ ｂｒｉｎｇｓ ａ ｈｕｇｅ ｈａｒｍ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ Ｆｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ ｏｆ ‘Ｘｓｕｓｈｕ １８’ａｎｄ ‘Ｓｈｅｎｇｌｉ １００’ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｒ ｔｏ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｂｕｌｋｅｄ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＳＡ）ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ８０ ＡＦＬＰ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ． Ａ ｍａｒｋｅｒ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ａｓ Ｅｃｏ（４５）－Ｍｓｅ（４５） ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｌｏｃｕｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｒｏｏｔ ｒｏｔ； ＡＦＬＰ ｍａｒｋｅｒ； BSA
甘薯是世界上重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源作物，我国是世界上最大的甘薯生产国家，甘薯年种植面积为３８６万ｈｍ２，鲜薯总产量８ １２１万ｔ。甘薯以其单位面积生物能产量高，且具有抗旱、耐瘠薄、适应性广、块根淀粉含量高等特性，是我国重要的淀粉类能源作物，在国家粮食安全、能源安全、生态安全、健康安全和农民增收等方面起着重要作用［１］。目前甘薯根腐病作为一种真菌性病害已经成为制约我国甘薯生产的三大严重病害之一，一般发病地块减产１０％~２０％，重病地块植株成片死亡甚至绝产。为控制甘薯根腐病的危害，提高甘薯种植效益，就甘薯根腐病进行分析研究十分必要［２］。
甘薯根腐病至今尚无有效的防治药剂，目前生产上对该病的防治主要以化学药剂防治为主，易引起农药残毒和环境污染，而且真菌能产生耐药性。不同的甘薯品种对甘薯根腐病的抗性有显著差异，选用甘薯抗病品种是防止甘薯根腐病发生和减轻病害的最经济有效的方法，相关研究表明甘薯根腐病抗性主要以基因加性效应控制，Ｆ１代抗病能力变异广，病情指数呈连续性变异。甘薯对根腐病的抗性是稳定的，同一条件下，不同年份变化不大［３］。不同抗病类型的亲本进行组合，Ｆ１可出现抗性不同的材料，其中高抗、抗、感、高感类型都有。总的趋势表现为双亲抗性水平越高的组合，其后代中出现高抗或抗病型的比例就越高［２］。
研究将ＡＦＬＰ技术与分离群体混合分析法（Bｕｌｋｅｄ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）相结合，通过筛选８０对引物，获得了一个与甘薯根腐病基因位点连锁的ＡＦＬＰ标记［４］，所获试验结果对甘薯抗病遗传改良具有指导意义。
１ 材料与方法
１．１ 材料
以高抗甘薯根腐病品种徐薯１８为抗病亲本，高感甘薯根腐病品种胜利百号为感病亲本，以二者杂交的植株Ｆ１代为试验材料。
１．２ 方法
１．２．１ 甘薯根腐病接种与抗性鉴定 甘薯根腐病接种与抗性鉴定均由徐州甘薯研究中心完成，供试材料也由该中心提供，２００６年与２００７年两年完成甘薯根腐病抗性鉴定，分别鉴定甘薯地上与地下两部分病情指数，抗性标准划分：高抗平均病情指数小于２０．０，抗病平均病情指数为２０．１～４０．０，中抗平均病情指数为４０．１～６０．０，感病平均病情指数为６０．１～８０．０，高感平均病情指数大于８０．１。
１．２．２ ＤＮＡ提取与抗感基因池建立 每单株选取幼嫩叶片采用改良ＣＴＡＢ法进行ＤＮＡ提取，ＤＮＡ质量采用紫外分光光度计和１％琼脂糖凝胶电泳双检测。将符合要求的ＤＮＡ样品稀释成浓度为１００ ｎｇ／μＬ待用。
随机选取３株高感病单株ＤＮＡ等量混合构建感病池，３株高抗病单株ＤＮＡ等量混合构建抗病池。
１．２．３ ＡＦＬＰ-PCR扩增反应及标记分析 ＡＦＬＰ分析采用ＥｃｏＲＩ和Ｍｓｅ Ｉ内切酶对甘薯基因组ＤＮＡ酶切，用ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ１、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ１，ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ２、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ２，ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ３、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ３，ＥｃｏＲＩ－ｐｒｅ４、ＭｓｅＩ－ｐｒｅ４ ４对选择性碱基的引物进行预扩增，预扩增引物稀释１０倍以后进行选择性扩增，选用Ｅ、Ｍ引物随机组合８０对，将扩增产物０．８ Ｌ上样于６．５％ 聚丙烯酰胺凝胶上进行变性电泳。
２ 结果与分析
２．１ 相关样品ＤＮＡ检测及ＡＦＬＰ多态性引物组合的筛选
ＤＮＡ样品结果如图１所示。用８０对引物在抗病和感病基因池之间进行多态性筛选，有２５对引物能产生多态性，选取其中表现最好的８对引物进行标记筛选。
２．2 ＡＦＬＰ标记与甘薯根腐病连锁分析
８对引物在亲本与抗病、感病单株上进行标记筛选，其中４对引物在亲本与抗病、感病单株上扩增出多态性条带，在标记连锁性方面，标记Ｅｃｏ（４５）－ Ｍｓｅ（４５）在感病亲本和３个感病单株上均出现特异条带，而在抗性亲本和3个抗病单株上未出现抗性条带。因此判定该标记与感病基因连锁。
３ 讨论
选择性基因型分析（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）最早由Ｌｅｂｏｗｉｔｚ等［５］提出，是增强信号的一种方法，其主要是在一个群体中选择高、低两种极端表型的个体构成一个亚群体，仅对该亚群体个体进行选择性分析，以此大大减少分子标记分析的人力物力花费。虽然极端表型亚群体的个体数远少于原群体，但其定位灵敏度和精确度却不亚于原群体，并可以大大提高分析效率。该方法已经成功用于人类和其他动物的遗传学研究。
通过对甘薯根腐病鉴定分析发现，在Ｆ１代群体中有大量介于抗感之间的中间类型，如果进行人为划分会对标记与基因连锁的分析产生很大的影响，而极端性状更加容易鉴定，所以选择性基因型分析结果更加可靠［６］。
研究在进行标记筛选的过程中，有多个相关标记被筛选出来，但是缺乏一定的稳定性，而定位的Ｅｃｏ（４５）－Ｍｓｅ（４５）标记则是稳定性较好的一个标记，下一步将扩大群体进行遗传距离的精确定位，同时寻找连锁更加紧密的标记。
参考文献：
［１］ 陆漱韵，刘庆昌，李惟基．甘薯育种学［Ｍ］． 北京：中国农业出版社，１９９８．
［２］ 李 鹏，马代夫，李 强，等．甘薯根腐病的研究现状与展望［Ｊ］．江苏农业科学，２００９（１）：１１４－１１６．
［３］ 刘宏谋，李明周．甘薯根腐病发生规律中的几个问题［Ｊ］．植物保护，１９８２（６）：29－30．
［４］ 董星光，方成泉，王 斐，等．梨抗黑星病ＡＦＬＰ标记筛选［Ｊ］．植物病理学报，２０１０，４０（５）：５５２－５５５．
［５］ ＬＥＢＯＷＩＴＺ Ｒ Ｊ，ＳＯＬＬＥＲ Ｍ，ＢＥＣＫＭＡＮＮ Ｊ Ｓ． Ｔｒａｉｔ―ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｋａｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｒｋｅｒ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｉｎ ｃｒｏｓｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８７，７３：５５６－５６２．
［６］ 李发玲，李景富，康立功，等．与番茄枯萎病抗病基因Ｉ－１连锁的ＡＦＬＰ和ＳＳＲ分子标记［Ｊ］．植物保护，２０１１，３7（１）：３７－４０．
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