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    【低温乙醇法在人血白蛋白工业化生产中的应用】人血白蛋白低温乙醇工艺

    时间:2018-12-23 19:50:59 来源:雅意学习网 本文已影响 雅意学习网手机站

      摘 要:人血浆中含有数量众多的蛋白成分,如何把它们分离开来一直是个比较热门的课题。二战时期,哈佛大学的Cohn教授发明了低温乙醇分离法后,血浆蛋白分离工业才得以蓬勃发展起来。本文将结合低温乙醇法的基本原理以及笔者实际的工作经验和体会,对人血白蛋白的工业化生产过程进行阐述。
      关键词:低温乙醇法 人血白蛋白 工业化生产
      
      人血浆中已经发现的蛋白成份约有100多种,其中已经分离提纯和性质明了的有60余种,大约20种已经有临床用途。血浆蛋白的分离,是利用不同蛋白成份的理化性质,如分子大小、密度高低、表面结构、荷电状态等的区别,将其互相分开。
      血浆蛋白分离工业在中国起步比较晚,直到上世纪80年代才真正开始了大规模的工业化生产,目前全国有30余家血制品生产企业,但其中大部分企业的主要产品仅有人血白蛋白和静脉注射用人免疫球蛋白这2种血浆中含量最大的成份,可以说对血浆资源的利用率是比较低的。
      血浆蛋白分离的方法很多,其中大部分方法只适用于实验室研究使用,如电泳、等点聚焦等,可以应用于大规模生产的只有沉淀法(盐析、有机溶剂法等)、层析法(凝胶层析、离子交换层析以及亲和层析),另外的超滤、吸附、变性处理等均为辅助手段。目前,国内用于生产人血白蛋白和免疫球蛋白类制品的生产方法基本都是低温乙醇法。笔者结合低温乙醇法的基本原理以及本人实际的工作经验和体会,对人血白蛋白的工业化生产过程进行阐述。
      人血白蛋白是一个一级结构简单的单链蛋白,无碳水化合物侧链,仅含少量的脂肪酸,构型较为对称,分子量约为69000D,由585个氨基酸残基组成,富含门冬氨酸及谷氨酸,而缺乏色氨酸。天然状态下,白蛋白含有19个负电荷,其i.e.p依溶液中含有的盐的种类与浓度的不同在pH4.4~5.4之间。
      低温乙醇法的原理和要点为:往蛋白质的水溶液中加入乙醇,产生几种效应,主要效应是降低水分子的活度,降低溶液的介电常数,从蛋白分子周围排代水分子,使蛋白分子和蛋白分子之间通过极性基团的相互作用在范德华引力下发生凝聚,从而沉淀下来。影响这种沉淀过程的主要有5大参数:溶液的蛋白浓度、pH值、离子强度、溶液的温度和乙醇的浓度。在前4个参数都一致的情况下,乙醇的沉淀作用取决于蛋白分子的大小。在逐渐提高乙醇浓度时,蛋白将按分子大小顺序先后沉淀。人血白蛋白作为血浆主要成分中分子量最小的一种,是在最后一步的沉淀反应中分离出来的。下面是人血白蛋白生产的简要工艺流程图。(其中的部分主要参数进行了模糊化处理)
      人血白蛋白制备工艺流程
      
      步骤①:原料血浆的检测。在现今血液传播疾病越来越令人恐惧的情况下,对血浆进行常见的5种病毒检测是国家的强制标准,而且必须是对每一袋单采血浆进行5项病毒检测,合格后方可投入生产。
      步骤②:8%乙醇沉淀反应,产生组份I沉淀,主要成分为纤维蛋白原。组份I沉淀可以用于人纤维蛋白粘合剂的生产。在此步骤之前一般会对原料血浆进行一次离心,可以分离得到冷沉淀,这也是制造凝血因子VIII的原料。离心去除冷沉淀之后的血浆可以用于人凝血酶原复合物(凝血因子II、VII、IX、X的混合物)的吸附生产。然后可以进行8%乙醇沉淀反应(若不生产凝血因子VIII和人凝血酶原复合物,也可以直接对原料血浆进行8%乙醇沉淀反应)。由于工业化生产中投入的血浆数量巨大(一般一次为5000千克血浆左右),反应罐的容积也是很大的,如我们公司使用的是5吨容量的罐。巨大的体积给乙醇浓度和pH值的调节带来了一些问题。显然我们不可能像在实验室中那样一边加入缓冲液一边搅拌,同时用pH计直接测试。实际采取的方法是:准确抽取10ml的溶液,滴定至指定的pH值,然后将所用的缓冲液量扩大到一个罐的反应液所需的量。一般情况下,需要加入的缓冲液量都会有数十千克,50%的乙醇大概会有500千克以上,往反应罐中加入这些液体的时候一定要控制好速度,加得太快会使局部pH值或酒精浓度超出限度而导致不良后果,加得太慢则会拖长生产周期。沉淀反应完成以后,需要将反应液静置数小时,以利于沉淀的积聚(一般还会按一定的比例往反应液中加入硅藻土作为助滤剂),而后就可以进行分离,以收集沉淀,同时将上清液转移入另外的反应罐以备进行下一步的沉淀反应。现今最常用的分离器具是压滤机(以前也经常使用高速离心机来分离沉淀,但其使用成本和工人的劳动强度均比压滤机要高,因此逐渐被压滤法取代),它其实就是一台大型的板框滤器,配合相应规格的滤板,反应液在压缩空气或泵的驱动下穿过滤器,沉淀被滤板截留在板框中,待液体过完后一并取出。每台压滤机大概可以容纳400千克以上的沉淀。
      步骤③:20%乙醇沉淀反应,分离出组份II+III沉淀,其主要成份为各种类型的球蛋白和凝血因子II、VII、IX、X。组份II+III沉淀可以用于免疫球蛋白类制品和人凝血酶原复合物的生产。上清液继续进入下一步的反应。
      步骤④:40%乙醇沉淀反应,分离出组份IV沉淀,主要成份为球蛋白、铜蓝蛋白和一些补体蛋白,同时还含有少量的白蛋白。组份IV沉淀也可以用于回收分离白蛋白。上清液继续进入下一步的反应。
      步骤⑤:40%粗制反应,分离出组份V沉淀,也就是白蛋白,一般5000千克的血浆大约能得到600千克左右(具体的量和沉淀的干湿程度等都有关系)的组份V沉淀,其蛋白含量约为25%~28%。上清液中仅含少量的蛋白,直接弃去。此步骤分离出的白蛋白还不是很纯,需要再进行一次纯化反应。
      步骤⑥:白蛋白纯化反应。通过这个步骤得到的白蛋白溶液,其纯度已经可以达到95%以上,但其中仍含有大量的乙醇和盐类,需要通过超滤的方法将其去除。
      步骤⑦:超滤脱醇及配制、灭活。这个步骤主要是去除蛋白溶液中的盐类和乙醇,然后加入一定量的辛酸钠,最后进行60℃10小时的巴氏灭活以确保人白制品的病毒安全性。血液制品在超过60年的使用历史中,只有经过巴氏灭活的人血白蛋白才被公认为是安全制品。辛酸钠在这里起的是保护剂的作用,一定浓度下可以帮助白蛋白忍受住60℃10小时的保温过程,但如果辛酸钠浓度过高,它也可能会保护病毒度过巴氏灭活。另外,如果是以组份IV沉淀为原料生产的白蛋白,由于其中含有较高浓度的PKA(激肽释放酶原复合物,有降压作用),在超滤脱醇前必须经过层析以去除大部分的PKA而保证制品的安全性。由于人血白蛋白为生物活性物质,无法承受剧烈的灭菌条件,所以,灭活完的蛋白溶液经过0.22微米的滤器过滤,就可以进行分装,这也对前面的各生产步骤提出了较高的洁净度要求。一般每5000千克血浆可以得到10克/瓶的人血白蛋白约12000支。
      步骤⑧:最后的处理。分装完毕后,制品还需要在30―32℃下放置14天,而后进行逐瓶灯检,观察其稳定性指标和外观情况。同时取样送检测部门,待结果合格后才能投入销售。
      一批人血白蛋白从开始投料到可以销售,大概需要一个半月到两个月多的时间。
      低温乙醇法生产人血白蛋白已经是一个比较成熟的方法,现今的主要问题就是如何进一步提高人血白蛋白的得率,这主要牵涉到各步骤的一些细微注意点,也是我们的技术部门一直在追求的目标。
      
      参考文献:
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      注:“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
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